2000 Fiscal Year Annual Research Report
子宮体癌における新しい抗原の同定と免疫遺伝子治療法の開発
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12671630
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
鈴木 ゆり子 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (40255435)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野澤 志朗 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (90051557)
河上 裕 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (50161287)
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| Keywords | SEREX / 子宮体癌抗原 / 発現スクリーニング |
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| Research Abstract |
子宮体癌由来の3細胞株を入手し、各々培養して約10^8細胞から全RNAを抽出した。3細胞株の全RNA各0.5mgを混合し、オリゴ(dT)によってポリA^+RNAの選別を2回行い約20μgのポリA^+RNAを得た。ZAP express cDNA synthesis kit (Stratagene社)を用い、5μgのポリA^+RNAからバクテリオファージcDNAライブラリーを作成した。1.2×10^6のプライマリーサイズのファージライブラリーを1回増幅し、1.0×10^<10>pfu/mlのタイターで使用した。4検体の子宮体癌患者血清(ステージIb1検体、ステージIIIc3検体)を2検体ずつ混合し(A,B)、作成した子宮体癌細胞株cDNAライブラリーからそれぞれ50万クローンをスクリーニングした。1混合検体につき、50枚の直径15cmのシャーレに各々約1万のプラークを生じるようプレートした。誘導試薬IPTGで組換体タンパクを大腸菌に発現させ、ニトロセルロース膜に転写した。ブロットしたニトロセルロース膜に1000倍希釈患者自己血清を加え、さらにアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトIgG抗体を加えて発色させた。混合A(4検体の内2検体)では20の陽性クローンを得ることができたが、これは11種類の遺伝子に相当した。得られたクローンの塩基配列を一部決定したところサイクリンE2、甲状腺ホルモン受容体結合タンパク、GTPアーゼ活性化タンパクなどであった。混合Bについてもスクリーニングを終え16の陽性クローンを得ることができた。今後さらにDNA塩基配列決定、RT-PCRなどを行う予定である。
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