表在性口腔がんの遺伝子治療への試み-腫瘍特異発現の検討-

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12671834
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 進藤 正信 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 助教授 (20162802)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小林 正伸 北海道大学, 遺伝子病制御研究所, 助教授 (80241321) ; 安田 元昭 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 助手 (90239765) ; 東野 史裕 北海道大学, 大学院・歯学研究科, 助手 (50301891)
• Keywords: survivin / アデノウイルスベクター / 転写調節領域

Research Abstract

1.RNAおよびタンパクレベルでのE1AFとSurvivinの発現
HSC2、HSC3、HSC4、OSC19、Ca9.22などの口腔扁平上皮がん細胞株よりRNAを抽出し、逆転写酵素によりcDNAを合成した。これを鋳型にして、PCRによりE1AFおよびSurvivinの発現を検索した。E1AFは口腔扁平上皮がんの約50%、Survivinは約40%に発現していた。メッセージレベルでの発現に加えて、ウェスターンブロッティングを用いたタンパクレベルの検索でも同様の所見が認められた。
2.E1AFとsurvivinの転写調節領域の解析
ヒトゲノムライブラリー(JCRB)よりヒトE1AF cDNAをプローブとしてgenomic clone IF1-20を得た。IF1-20の上流域をさらに5′-RACE法を用いて解析し、E1AF遺伝子の転写調節領域(プロモーター)のクローニングを行った。シークエンスの結果、E1AFの上流域には、TATA boxは認められなかったが、CAAT boxが存在し、p53、AP2、Sp1の結合配列が認められた。得られたE1AFプロモーター領域をルシフェラーゼ遺伝子を含むpGL2レポータープラスミドに組み込みんだ。同様の解析をsurvivinについても行っている。
3.アデノウイルスベクターの構築
pAd Bgl II CMV BGHpAのCMVプロモーターをE1AFプロモーターに置き換え、その下流にアポトーシスを誘導することが知られているBcl-2遺伝子ファミリーに属するBIKおよびBNIP3遺伝子を組み込んだpAd-E1AF-BIKおよびpAd-E1AF-BNIP3を構築した。