2000 Fiscal Year Annual Research Report
細胞内情報伝達網におけるNDPキナーゼの位置と機能
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12672149
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology |
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Principal Investigator |
島田 信子 (財)東京都老人総合研究所, 遺伝子情報部門, 助手 (60158962)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石嶋 康史 科学技術振興事業団, 科学技術特別研究員
木村 成道 (財)東京都老人総合研究所, 遺伝子情報部門, 室長 (60073029)
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| Keywords | NDPK / 三量体G蛋白 / PACAP / cAMP / PC12D / トランスフェクション |
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| Research Abstract |
NDPKの細胞内情報伝達経路上の作用点の解明を目的とし、本年度は以下の二点に絞って実験を行った。
(1)トランスフェクション実験システムの確立
本来培養細胞への遺伝子導入実験はその機能探索に有効であるはずの手段であるが、NDPKの場合、高発現株が得にくいなどの理由から困難であった。まず、この問題をクリアするため、通常の発現システムより高効率、細胞毒性が低く、発現レベルがコントロール可能であるとされるテトラサイクリン誘導制御レトロウィルス発現システムを立ち上げた。正常NDPK並びに不活化NDPK組換えベクターの構築まで完了した。
(2)NDPKが三量体G蛋白へのGTP供給システムとして機能していることの細胞レベルでの証明
まず、上記の改変NDPKのPC12D細胞安定発現株(既に確立されていたもの)で、分化に伴う神経突起伸長が抑制されるドミナントネガティブ系(不活化NDPK発現クローン)を用い、PACAP受容体刺激によるcAMPレベルの変動を観察した。
この系では、細胞内総NDPK活性は維持されているが、局所での競合阻害の効果が期待され、実際PACAPによるcAMP応答レベルの低下が30-50%の範囲で再現性よく確認された。一方この細胞クローンの、G蛋白を介さないForskolinに対する反応性は親細胞と全く変わらなかった。In vitro系においては、わずかなNDPK活性によってもG蛋白活性化が達成されることが判明していることから、今回in vivo系において、完全ではないが有意のドミナントネガティブ効果がみられたことの意味は大きく、NDPKが三量体G蛋白の機能に生理的に関与することの一つの根拠になると考えられる。
今後更に他方面からの解析を加えて行く予定である。
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