核酸の新しい超高感度酵素免疫測定法の開発とその応用(HIV感染の早期診断)

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12672247
• Research Institution: Miyazaki Medical College
• Principal Investigator: 橋田 誠一 宮崎医科大学, 医学部, 助教授 (10156268)
• Keywords: 酵素免疫測定法 / 核酸 / HIV-1 / 早期診断 / RT-PCR / RNA / DNA / β-D-ガラクトシダーゼ

Research Abstract

従来のHIVやHCV等のプロウイルスDNAやウイルスRNAの測定法は、理論値とは程遠い検出感度(数百〜数万コピー)である。これは、蛍光、発光物質や酵素標識した標識物の非特異結合によるシグナルが、測定系の高感度を妨げているためである。そこで、申請者らが開発した2点結合(特異結合物質・測定物質)複合体転移法という画期的な方法を用い、特異シグナルは維持し、非特異シグナルをほぼ完全に除去することにより、超高感度測定を可能とすることを目的とした。昨年度は、HIV-1 P24抗原の超高感度測定法とRT-PCR法の検出感度を、Seroconversion panel serumを用い、比較検討した。その結果、P24抗原とRNAの検出時期は殆ど同時期であった。この時のRT-PCR法の検出限界は、400コピー/mlであった。しかし、抗p17 IgGやIgMが p24抗原やウイルスRNAの検出時期より早期に検出されたため、この抗p17 IgGやIgMの検出時期以前にウイルスRNAの存在が示唆された。しかし、現法のRT-PCR法では、このような早期には、ウイルスRNAを検出することができなかった。そこで、RT-PCR後のDNAプローブとのハイブリダイゼイション以降の高感度化を検討した。β-D-ガラクトシダーゼを標識したDNAプローブを用い、2点結合法による検出を試みたが、非特異結合が異常に大きく、検出感度はpmolレベルであった。本年度は、非特異結合を完全に除去するために、上記方法に転移法を加え、非特異結合を低下させた。FITC・DNP標識アビジン-ビオチン化DNA・プローブIとβ-D-ガラクトシダーゼ標識アビジン-ピオチン化DNA・プローブIIを用い、測定すべき増幅DNAとハイブリダイゼイション、続いて、抗DNP IgG不溶化固相上にトラップする。洗浄後、過剰のDNP-リジン添加により、複合体を固相より溶出し、抗FITC IgG不溶化固相上に転移させる。最後に、固相上の酵素活性を測定する。この転移法を用いたところ、10amol(10^<-17>mol)の検出が可能となった。PCRにより10^<6〜8>コピーの増幅が可能であるため、最低でも、10^<-23>mol(6分子)の検出の見通しがえられた。

Research Products

• [Publications] Kazuya Hashinaka: "Preparations of recombinant HIV-1 p66 antigen to improve the specificity of immune complex transfer enzyme immunoassay of antibody IgG to HIV-1 reverse transcriptase"Journal of Clinical Laboratory Analysis. 14. 169-179 (2000)
• [Publications] Setsuko Ishikawa: "Ultrasensitive enzyme immunoassay of antibody IgG to HIV-1 reverse transcriptase by immune complex transfer with detergents"Analytical Letters. 33. 2183-2196 (2000)
• [Publications] Seiichi Hashida: "Earlier detection of human immunodeficiency virus type 1 p24 antigen and immunoglobulin G and M antibodies to p17 antigen in seroconversion serum panels by immune complex transfer enzyme immunoassays"Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7. 872-881 (2000)
• [Publications] Kazuya Hashinaka: "Recombinant p51 as antigen in an immune complex transfer enzyme immunoassay of immunoglobulin G antibody to human immunodeficiency virus type 1"Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7. 967-976 (2000)
• [Publications] Hideki Katakami: "Development of a highly sensitive immune complex transfer enzyme immunoassay (EIA) for rat growth hormone-releasing hormone"Clinical Pediatric Endocrinology. 10. 55-60 (2001)