GFP変異体を用いた蛋白分子2量体形成の可視化と細胞内情報伝達研究への応用

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12680656
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 岩根 敦子 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (30252638)
• Keywords: グリーン発光蛋白質 / イメージング / 2量体形成 / 蛍光エネルギー移動法

Research Abstract

細胞の増殖・分化を担っているシグナル伝達因子の活性化機構は未だ不明な点も多いが、蛋白質の2量体化やリン酸化による蛋白質の修飾が活性化に重要な役割を果たしているらしい。そこで、蛋白質の2量体化を人為的に起こし、その活性化への効果を調べる。低分子量G蛋白質Rasの下流で相互作用するRaf-1に着目してRaf-1の2量体化がRaf-1の活性化に必須であるのかどうか?また、実際Raf-1が活性化される場所はどこか?また、どの位の分子数が活性化されると細胞の形態変化が導かれるのかを生物物理学と分子生物学的手法を用いて解明したい。2量体化の確認は生物蛍光蛋白質間で生じると考えられるFRETの技術を利用することにした。
今年度は(1)DNA gyrase BのN-末側サブドメイン(GyrB)と生物蛍光蛋白質(CFP,GFP,YFP,DsRed)との融合蛋白質を約95%の純度の組換え体として得、溶液系でCFPとYFPの2量体化に伴うFRETがCoumermycin添加により観察された。また、それら蛍光蛋白質が目的のイメージングに適しているかについて顕微鏡の開発も行った。役者の数を知るために重要であると思われるこれら生物蛍光蛋白質の1分子レベルでのイメージング並びに蛍光特性を調べ、次の様な結果を得た。(2)GFP,YFP,DsRedは1分子レベルでイメージングする事が出来、さらに1分子レベルでのスペクトル測定の結果より、GFPやDsRedのスペクトル重心のばらつきは従来1分子レベルでのFRETに用いられてきた蛍光色素(Cy3等)と同程度であり、1分子レベルのFRETに用いることが可能であることが解った。
現在、溶液系での結果をふまえ、Raf-1にGyrB-CFP又はGyrB-YFPを結合させた融合蛋白質を細胞内で発現させ、生きた細胞内でのRaf-1の2量体化を行い、2量体化と活性化との関係を実時間で観察する系の立ち上げを行っている。

Research Products

• [Publications] Toshio Yanagida: "A large step for myosin."Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97. 9357-9359 (2000)
• [Publications] Toshio Yanagida: "Single molecule techniques inbiophysics."The proceedings of the 9^<th> international conference on Na/K Pump and related pumps.ISC. 1207 (2000)
• [Publications] Yoshikazu Miyamoto: "Direct Inhibition of Microtubule-based Kinesin Motility by Local Anesthetics."Biophys.J.. 78. 940-949 (2000)
• [Publications] Toshio Yanagida: "Single molecule analysis of the actomyosin motor."Current Opinion in Cell Biology.. 12. 20-25 (2000)
• [Publications] Toshio Yanagida: "Single motor mechanics and models of the myosin motor."The Royal Society Philosophical Transactions B.. 355. 1-7 (2000)
• [Publications] Atsuko Hikikoshi Iwane: "Visualization of dimerization using fluorescence resonance energy transfer (FRET) imaging between biofluorescent proteins."Biophysics. 40. 177 (2000)
• [Publications] Hideyuki Matsuura: "Single molecule imaging of small G protein Ras."Biophysics. 40. 32 (2000)
• [Publications] Kazuo Kitamura: "A single myosin head moves along an actin filaments with regular steps during one biochemical cycle of ATP hydrolysis."Biophysics. 228. 89-93 (2000)
• [Publications] Kayo Hibino: "Spatiotemporal dynamics of Ras/cRaf-1 interaction in the plasma membrane of living cells."Biophysics. 40. 76 (2000)
• [Publications] Hiroto Tanaka: "The step size, processivity, and velocity of myosinV are independent on its neck length."Biophysics. 40. 202 (2000)
• [Publications] Kazuo Kitamura: "Single molecule analysis of actomyosin motor : Load dependece."Biophysics. 40. 202 (2000)
• [Publications] Yuji Kimura: "Laser trappong nanometry with DIG DNA probe."Biophysics. 40. 203 (2000)
• [Publications] Atsuko Hikikoshi Iwane: "Visualization of protein dimerization using fluorescence resonance energy transfer imaging between biofluorescent proteins."第23回 日本分子生物学会年回. 684 (2000)
• [Publications] Yoshiyuki Arai: "Behavior of small G protein Ras revealed by single molecule imaging."第23回 日本分子生物学会年回. 684 (2000)
• [Publications] Tomonobu Watanabe: "Single molecule imaging of the process of regulation by the kinesin tail domain."第23回 日本分子生物学会年回. 797 (2000)
• [Publications] Hiroto Tanaka: "The motor domain, not a long neck domain, determines the large step of myosinV."Biophysical J.. 80. 81a (2001)
• [Publications] 岩根敦子: "GFPとバイオイメージング"羊土社. 10 (2000)