真核生物のバイパスDNA合成に関与するDNAポリメラーゼ・ゼータの生化学的解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12680676
• Research Institution: NARA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
• Principal Investigator: 秋山 昌広 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (80273837)
• Keywords: バイパスDNA合成 / 損傷乗り越えDNA複製 / DNAポリメラーゼ / DNAポリメラーゼ・ゼータ / REV3遺伝子 / DNA損傷 / 突然変異 / 複製フォーク

Research Abstract

DNA損傷による複製フォークの進行阻害を回避する経路の一つにバイパスDNA合成機構(損傷乗り越えDNA複製)があり、真核生物では従来の複製型DNAポリメラーゼとは性質の異なるDNAポリメラーゼζ(ゼータ)が関与している。これまでに明らかにされていない脊椎動物のバイパスDNA合成機構の解明を目的として、本研究ではアフリカツメガエルのDNAポリメラーゼζの精製、およびDNAポリメラーゼζの作用機構の検討を行う。
今年度の研究成果は、アフリカツメガエルの卵母細胞抽出液中に内在性のDNAポリメラーゼζの触媒サブユニットであるREV3蛋白質を初めて同定できたことである。
1.アフリカツメガエルの卵母細胞抽出液からDNAポリメラーゼζをホロ酵素として単離するため、まず触媒サブユニットREV3蛋白質の同定を目指したが、これまで卵母細胞抽出液中にREV3蛋白質を同定できなかった。昨年度、コドンバイアスを補正することによってREV3遺伝子の一部を大腸菌で発現させる系の構築に成功し、この系を使って2種類のREV3遺伝子断片を大腸菌で発現させた。発現したREV3部分蛋白質を精製し、それぞれに対する抗体を新たに作製した。これらのエピトープの異なる抗体を用いた免疫沈降とウエスタンブロットにより、REV3蛋白質の予想される大きさに一致する分子量約350kDaの蛋白質をアフリカツメガエルの卵母細胞抽出液中に同定できた。
2.試験管内でバイパスDNA合成を検出する系の構築にも成功し、卵母細胞抽出液中には少なくとも3種類のバイパスDNA合成活性が存在することを明らかにした。同定したREV3蛋白質を含む蛋白質画分とこれらの活性との関係については現在検討している。