線虫C.elegansのフコース転移酵素遺伝子の生化学的・遺伝学的解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12680679
• Research Institution: SOKA UNIVERSITY
• Principal Investigator: 近藤 和典 創価大学, 工学部, 講師 (10211913)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西原 祥子 創価大学, 生命科学研究所, 教授 (00164575)
• Keywords: 糖転移酵素 / フコース転移酵素 / C.elegans / 線虫 / 分子生物学 / 分子遺伝学

Research Abstract

我々は、糖鎖の機能を知る上において、まず糖転移酵素に着目してこれに的を絞り、線虫C.elegansの系を用いて研究している。線虫のゲノム上にはα1,3フコース転移酵素遺伝子と考えられるものが5個存在し、これらのcDNAをRT-PCRによってクローニングした。これらがフコース糖転移酵素であることを確認し、さらに酵素間の基質特異性の違い、発現組織・時期などを明かにするため、これらを発現させ活性を測定した。哺乳類細胞の系、あるいは、系統的に哺乳類よりも線虫により近い昆虫の系:pBacPAK(Baculovirus)-Sf細胞(夜盗蛾)を用いて分泌発現させ、細胞抽出液のLeX合成活性を測定したが高い活性は見られず、線虫のこれらのフコース転移酵素は、基質特異性等の特性が、哺乳類のものとは大きく異なることが明らかになった。現在、天然の線虫のアクセプター基質、あるいはそれらと同じ構造を持つと推定される昆虫等のものをアクセプター基質としてフコース転移活性の測定を試みている。さらに、それらの遺伝子の生物学的機能を推定する目的で、対応する遺伝子の突然変異体を分離するため、The C. elegans Gene Knockout Consortiumと共同で、欠失処理した線虫ライブラリーからこれら5個の遺伝子の欠失変異体をPCRで検出する方法を試みている。また、RNA interference(RNAi)は、二本鎖のRNAを個体に導入することにより、対応する遺伝子ノックアウトと同様の表現型が観察される現象である。この方法を用いるため、これら5個のフコース転移酵素遺伝子を、RNAを合成するためのベクターにサブクローンした。現在、最も簡便なソーキング法を用いてRNAiを試みている。