真核細胞の二重鎖DNAひねり因子の構造と機能に関する研究

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12680686
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 室伏 擴 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助教授 (70101128)
• Keywords: Xenopus卵 / HeLa細胞 / DNA複製 / SSRP1 / Cdc68p / FACT / クロマチン / HMGタンパク質

Research Abstract

申請者らは、ツメガエル卵抽出液からDNA複製開始に必要なDNAひねり因子を精製した。この因子は、分子量140kDa(Cdc68pの類似体)と87kDa(hSSRP1の類自体)のサブユニットから成り、二重鎖DNAに負のねじれを導入する活性を持つ。本研究では、ヌクレオソームの構造に対するDNAひねり因子の作用をしらべる。また、ツメガエル卵のDNA複製開始におけるDNAひねり因子の作用機序を明らかにし、クロマチン構造をとったSV40DNAの複製に対するDNAひねり因子の作用を調べることによって、真核細胞のDNA複製開始に必要なクロマチンの構造変化の機構を解明することを目的とした。
ヒトDNAひねり因子の140kDaサブユニットにHisタグを付加したクローンと、hSSRP1のクローンをバキュロウイルスに組み込み、両サブユニットを共発現させ、Niキレートカラム、SP、およびHAカラムを用いて精製した。今後、クロマチン構造をとったSV40DNAのin vitroでの複製に対するDNAひねり因子の作用を解析する予定である。両サブユニットに対する抗体を用いて、A6細胞とHeLa細胞を染色したところ、核全体、特に、核小体が染色された。HeLa細胞から単離された核にはDNAひねり因子が結合しており、高塩濃度溶液によって抽出された。抗体を用いてDNAひねり因子を除いたツメガエル卵抽出液中で形成されたクロマチンと、DNAひねり因子を含む卵抽出液中で形成されたクロマチンとに対するヌクレアーゼ感受性を調べたところ、前者よりも後者のほうが感受性が高かった。さらに、精製DNAひねり因子は、二重鎖DNAのみならず、ヒストンを固定化させたカラムに結合した。以上の結果から、DNAひねり因子は、DNAおよびヒストンに結合してクロマチン構造をゆるめ、DNA複製が起こりやすくする働きがある考えられる。

Research Products

• [Publications] Yamada,T.: "p97 ATPase, an ATPase involved in membrane fusion, interacts with DNA Unwinding Factor (DUF) that functions in DNA replication"FEBS Lett.. 466. 287-291 (2000)
• [Publications] Kitazawa,H.: "Ser787 in the proline-rich region of human MAP4 is a critical phosphorylation site that reduces its activity to promote tubulin polymerization"Cell Struct.Funct.. 25. 33-39 (2000)