2000 Fiscal Year Annual Research Report
グリア芽細胞の移動メカニズムの解明:2種類の蛍光分子で標識された生きた細胞の観察
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12680770
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
柿田 明美 新潟大学, 脳研究所, 助教授 (80281012)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山田 光則 新潟大学, 脳研究所, 助教授 (30240039)
高橋 均 新潟大学, 脳研究所, 教授 (90206839)
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| Keywords | グリア芽細胞 / 細胞移動 / 未分化細胞 / レトロウィルス / 蛍光分子 / subventricular zone |
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| Research Abstract |
中枢神経系の発生過程における神経芽細胞・グリア芽細胞の移動メカニズムを解明する目的から、これら未分化細胞とラジアルファイバーの移動・運動動態を生きた状態で直接観察する研究を実行中である。本年度末までに、以下の研究を行った。
1.シアン色および黄色蛍光のcDNAをコードしたレトロウィルスベクターの作製。
pECFP-Mem及びpEYFP-Memベクターから、シアン色及び黄色蛍光のcDNAフラグメントを切り出し、これをレトロウィルスベクター(pQNCX-2及びpLNCX-2)に組み込んだ。これらウィルスベクターをパッケージング細胞株(EcoPack293)にtransfectionし、薬剤耐性及び細胞株の蛍光強度を指標に、導入遺伝子が安定に発現している細胞株を選定した。NIH3T3細胞株を標的細胞としたウィルスの力価検定を行い、最も高力価のクローンを単離した。これらは安定かつ十分な蛍光強度を有し、かつ互いに識別可能な色調を発することを確認した。この結果、目的とする2種類のレトロウィルスベクターの作製に成功した。また、超高速遠心により、感染力価が1x10^6CFU/ml程度のウィルス含有液を作製した。
2.subventricular zone(SVZ)及び脳室内へのstereotactic injection。
マイクロマニプュレイターを用い、出生当日のラット(P0)の前脳片側SVZ及び脳室内に上記レトロウィルス含有液をstereotacticに微量注入する方法を確立した。即ち、新生児の頭頂部及び対側側頭部からの2方向性アプローチにより、SVZおよび脳室内にそれぞれ1,10μlのウィルス液を注入する条件を見出し、児が術後も安定して生育し得ることを確認した。
3.生鮮スライス培養。
tissue chopperを用いて250μm厚の生鮮脳冠状断スライスを作製し、スライスごと培養する系を確立した。また、これらスライス内の蛍光シグナルを捕らえるフィルターを備えた倒立顕微鏡のセットアップを終了した。
4.上記の予備的実験を終了し、次年度には蛍光分子で標識された細胞・構造物の動きを生きたスライス内で観察し、これら動態とその関連性を明らかにする計画である。
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[Publications] Akiyoshi Kakita: "Migration pathways and behavior of glial progenitors in the postnatal forebrain."Human Cell. 14・1(印刷中). (2001)
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[Publications] Akiyoshi Kakita: "Aprosencephaly : histopathological features of the rudimentary forebrain and retina."Acta Neuropathologica. (印刷中). (2001)
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[Publications] Akiyoshi Kakita: "Intrauterine methylmercury intoxication. Consequence of the inherent brain lesions and cognitive dysfunction in maturity."Brain Research. 877. 322-330 (2000)
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[Publications] Akiyoshi Kakita: "Distinct pattern of neuronal degeneration in the fetal rat brain induced by consecutive transplacental administration of methylmercury."Brain Research. 859. 233-239 (2000)
