GFP発現ベクターによるエンケファリン含有ニューロンの同定

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12680798
• Research Institution: Dokkyo Medical University
• Principal Investigator: 堀 雄一 獨協医科大学, 医学部, 教授 (60190229)
• Keywords: GFP / エンケファリン / エンケファリン プロモーター / 脊髄後角ニューロン / パッチクランプ記録 / 脊髄切片培養 / 遺伝子銃

Research Abstract

1.エンケファリンプロモーター組み込みGFPベクターの作成
マウスC57/BLACK6ゲノムDNAをテンプレートとし、PCRによりプロモータ領域を増幅し、塩基配列を確認した。この方法で、エンケファリン遺伝子のエクソン1から上流におよそ2700bpまでのプロモータ領域が得られた。当初は、このPCR産物をGFP発現ベクターに組み込むことを考えた。しかし、これでは、GFPを発現させるために、フオルスコリンなどの刺激が必要と考えられた。さらに、この方法では、生理的な状態ではエンケファリンを発現していない神経細胞にもGFPが発現してしまう可能性が高いと考えられ、本研究の目的を達することが出来ない。
エンケファリンのcoding配列はエクソン3に含まれており、さらに、イントロンAおよびイントロンBに含まれる配列が、エンケファリンの発現を調節している可能性が示唆されている。そこで、新たに、エクソン3の3′-端からエクソン1の5′-端までをPCRで増幅した。現在、このPCR産物の塩基配列を検討中である。さらに、このPCR産物を前述のプロモータ配列とligationすることにより、全長およそ7.8kbpのコンストラクトを得る予定である。
2.中枢神経スライス標本への遺伝子導入法の検討
遺伝子銃による遺伝子導入の準備として、生後6-10日のラットおよびマウスの脊髄の厚さ約200〜400mmのスライス標本を作製し、約2週間まで培養が出来るようになった。
3.Enk含有ニューロンの電気生理学的、薬理学的性質の検討
我々が確立した単一細胞RT-PCR法によって同定したエンケファリン含有ニューロンからパッチクランプ記録を行い、その電気生理学的・薬理学的性質を検討する実験を合わせて行なった。エンケファリン含有ニューロンには、バルビツレートによって、強い過分極と活動電位の発生の抑制が見られた。

Research Products

• [Publications] K.Wake: "Exaggerated responses to chronic nociceptive stimuli and enhancement of N-methyl-D-aspartate receptor-mediaeted synaptic transmission in mutant mice lacking D-amino-acid oxidase"Neuroscience Letters. 297. 25-28 (2001)
• [Publications] H.Yamazaki: "Effects of barbiturate on enkephalinegic superficial dorsal horn neurons of the rat spinal cord"Society for Neuroscience Abstracts. 26. 1218 (2000)