糸状菌転写促進因子CCAAT結合複合体のサブユニットに関する機能ドメイン解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12760052
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 加藤 雅士 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 助手 (70242849)
• Keywords: 糸状菌 / CCAAT / Hap / タカアミラーゼA / 転写因子 / AnCP / A.nidulans / 麹菌

Research Abstract

(1)部分欠失サブユニットの取得;麹菌Hap複合体のサブユニット遺伝子AohapB,AohapC,AohapEを出発材料として、それぞれ部分欠失変異を作製した。これら部分欠失サブユニットとGST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)との融合蛋白質を大腸菌において発現させた。
(2)部分欠失サブユニットのin vitro解析;GST融合蛋白質をグルタチオン固定化樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製を行った。3つのサブユニットについて、それぞれ部分欠失サブユニットと全長サブユニットの組合わせでCCAAT結合複合体の再構成を行い、DNA結合に関して解析を行なった。その結果、いずれのサブユニットに関しても、少なくともコア領域(真核生物間で高度に保存されている領域)さえあれば、CCAAT配列に特異的に結合できることが示された。
(3)核画分のフラクショネーション法の確立;AnCPのサブユニットの核への局在化能を評価するために、糸状菌から核を単離する方法を改良して、菌糸破砕試料より核画分を迅速に分画できるフラクショネーション法を確立した。野性株に加え、AohapB,AohapC,AohapE欠失株より調製した試料を抗HapB,HapC,HapE抗体でイムノブロット解析することにより、それぞれのサブユニットの核への局在化を解析した。その結果、野性株および全ての欠失株において全てのサブユニットが核画分から検出され、複合体の形成とは関係なくサブユニットの核移行が行われていることが明かとなった。

Research Products

• [Publications] Kato,M.: "A simple and rapid method for the preparation of a cell-free extract with CCAAT-binding activity from filamentous fungi."Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64. 455-457 (2000)
• [Publications] Tani,S.: "A novel nuclear factor, SREB, binds to a cis-acting element, SRE, required for inducible expression of the Aspergillus oryzae Taka-amylase A gene in A.nidulans."Molecular and General Genetics. 263. 232-238 (2000)
• [Publications] Tanaka,A.: "An Aspergillus oryzae CCAAT-binding protein, AoCP, is involved in the high-level expression of Taka-amylase A gene."Current Genetics. 37. 380-387 (2000)
• [Publications] 加藤雅士: "カビの有用酵素生産に関与する転写因子"化学と生物. 39. 40-46 (2001)
• [Publications] 加藤雅士: "カビにおけるキシラン分解酵素の遺伝子発現調節の研究とその多面的応用"New Food Industry. 43. 27-32 (2001)