納豆菌ポリ-γ-グルタミン酸合成酵素の構造と反応機構

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12760062
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 芦内 誠 高知大学, 農学部, 助教授 (20271091)
• Keywords: ポリ-γ-グルタミン酸 / Bacilluo subtilis / ポリ-γ-グルタミン酸合成酵素複合体 / アシドリガーゼ / DL-グルタミン酸 / ポリ-γ-グルタミン酸高生産株 / 高機能性バイオポリマー / リボソーム非依存性ポリペプチド合成機構

Research Abstract

本年度は、ポリ-γ-グルタミン酸(PGA)合成酵素複合体PgsBCAの精密解析のための基盤技術となる酵素効率生産系について検討を加えるとともに、PGA生産に関わる遺伝子解析及び大量生産システムの構築に有用な新規PGA生産菌を検索した。以下に得られた成果を示す。
1、PGA合成酵素複合体PgsBCAの大量発現は宿主に対して著しい生育阻害をもたらすことが判明した。そこで、各々の成分、つまりPgsB、-C、及び-Aを単独で生産できる宿主ベクター系を検討した。GST融合ベクターを基本に、PgsBは分子シャペロン共生産システムで、PgsCはPGA生産菌を宿主とする系で、また、PgsAは培養温度の急激な低温シフトが本タンパク質の成熟化に重要であることを見い出した。リポソーム膜を利用したPgsBCAの再構成についても検討し、これにより本酵素複合体の精密解析が可能となった。
2、有用PGA生産菌として戦国醤菌を単離した。本菌の膜成分を利用し巨大PGAの酵素合成に世界で初めて成功した。極めてユニークな基質特異性を明らかにするなど、PGA合成に関する重要かつ新奇な情報を得るに至った。また、pgsBCA遺伝子破壊株はPGAの生産能を完全に失ったことから、PgsBCAのPGA合成における必須性が証明された。
3、PGAを環境適応因子として生産する生物、ここでは好アルカリ細菌と好塩古細菌のPGAの構造解析を行い、これらが従来知られていなかった新奇なポリアミノ酸であることを明らかにした。さらに、好アルカリ細菌のPGAは納豆菌などのそれとは全く異なる新奇な機構で合成されていることを明らかにした。
これらの結果の一部はすでにいくつかの英文誌、和文誌で発表し現在印刷中のものもある。投稿準備中の論文も複数あり、今回の研究成果は、これまでは手探りの感のあったPGA研究の発展に少なからず寄与できたものと考えている。

Research Products

• [Publications] Makoto Ashiuchi et al.: "Physiological and biochemichol characteristics of Poly-γ-glutamate synthetage complex of bacillus subtilis"European Journal of Biochemistry. 268. 5321-5328 (2001)
• [Publications] Makoto Ashiuchi et al.: "Isolation of Bacillus subtilis (chang kook jang), a poly-γ-glutamate producer with high genetic competence"Applied Microbiology and Biotechnology. 57. 764-769 (2001)
• [Publications] Makoto Ashiuchi et al.: "Biochemistry and molecular genetics on poly-γ-glutamate synthesis"Applied Microbiology and Biotechnology. (印刷中). (2002)
• [Publications] 芦田 誠 他: "『納豆の糸』の主成分ポリ-γ-グルタミン酸:その機能と生産メカニズム"バイオサイエンスとインダストリー. 60. 27-30 (2002)
• [Publications] 芦田 誠 他: "ポリ-γ-グルタミン酸の環境適応因子としての機能"化学と生物. (印刷中). (2002)