FMN結合タンパク質における特殊なFMN結合様式

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12760065
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 北村 昌也 大阪市立大学, 工学部, 講師 (20244634)
• Keywords: FMN / X線結晶構造解析 / 2量体 / 動的光散乱 / 硫酸還元菌 / タンパク質工学 / 解離定数 / 酸化還元電位

Research Abstract

硫酸還元菌由来のFMN結合タンパク質について、タンパク質工学的研究を行った。野生型FMN結合タンパク質の結晶構造解析の結果、ユニットセル当たり2分子となっており、また、ペプチド鎖同士が相互作用をしている事がわかった。さらに詳細な構造解析を行ったところ、2量体を形成する事によってペプチド鎖とFMNの結合を強めている事を示唆した。そこで、カルボキシル末端に存在する122番のロイシン残基に着目した。この残基は、FMNのイソアロキサジン環近傍に存在し、2量体形成に重要であると考えた。この残基を欠失させた変異型FMN結合タンパク質およびチロシン、リジン、グルタミン酸に置換した変異型FMN結合タンパク質を遺伝子工学的に創出し、その性質を調べた。その結果、122番のロイシン残基を欠失ないしチロシンヘ置換することによって、モノマー同士の結合が強まっていることを、超遠心場における拡散平衡測定により明らかにした。この事は、動的光散乱法の結果とも一致した。しかし、FMNとの結合においては、チロシン改変体を除いてすべて弱まっていたが、特に欠失変異体では非常に弱まっていた。一方、リジン改変体の酸化還元電位は、若干正にシフトする一方で、グルタミン酸改変体では、大きく負に変化した。これらの結果から、122番のロイシン残基は、FMNを結合するために必要な空間を確保すると同時に2量体間に適当な距離を作る以外に、酸化還元電位にも大きな影響を与えていると考えた。平成13年度は、これらの改変体の詳細な構造解析を行い、高次構造、特に結晶水やFMNの溶媒への露出度と酸化還元電位やFMNとの解離定数などの関係を明らかにしていく予定である。

Research Products

• [Publications] Kyoko Suto: "How do the X-ray Structure and the NMR structure of FMN-binding protein differ?"Acta Crystallographica. D56. 368-371 (2000)
• [Publications] Masaya Kitamura: "Cloning and Expression of the Catalase Gene from the Anaerobic Bacterium Desulfovibrio vulgaris (Miyazaki F)"Journal of Biochemistry. 129(3). 357-364 (2001)