遺伝子ノックアウトリーシュマニア原虫の作出および生ワクチンとしての有効性の検討

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12760197
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 松本 安喜 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (90251420)
• Keywords: リーシュマニア / Leishmania donovani / L.amazonensis / LACK / 遺伝子ノックアウト / 遺伝子クローニング / アンチセンス / リボザイム

Research Abstract

遺伝子欠損リーシュマニア原虫株を利用した弱毒生ワクチンは,病原性を獲得した復帰変異体が出現しないことから安全性の面で有望視されている.本研究においては,Leishmania homolog of C kinase receptor(LACK)遺伝子ノックアウトリーシュマニア原虫を作製し,組み換え原虫の病原性・免疫原性等を検討し,ワクチンとしての可能性を探ることにある.
当研究室で既にクローニングしたLeishmania donovaniおよびL.amazonensis由来LACK cDNAをプローブとして,L.donovaniおよびL.amazonensisプロマスティゴートより細胞DNAを抽出し,サザンブロット解析によりLACK遺伝子を検出した.L.amazonensisおよびL.donovaniの両株において,cDNAに認識部位のない制限酵素処理により同程度の強さの2本のバンドが得られ,LACK遺伝子は,リーシュマニア原虫ゲノム中に2コピー存在することが示唆された.現在,MboI部分消化によりゲノムライブラリーを作成している.
一方で,LACK遺伝子の塩基配列は,リーシュマニア原虫株間で高度に保存されていることから,リーシュマニア原虫にとって必須遺伝子である可能性がある.本年度は,LACK遺伝子が必須遺伝子であるかどうかを明らかにする目的で,(1)アンチセンスLACK mRNAを産生する組み換えリーシュマニア原虫の作製,(2)LACKアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入,(3)LACK mRNAを特異的に切断するリボザイムを発現するプラスミドを挿入した組み換えリーシュマニア原虫の作製を行った.しかし,これまでのところ,発現プラスミドのマーカーであるツニカマイシン耐性の原虫は得られたが((1)および(3)),それらの組み換え体および(2)のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理原虫において,LACK低(非)発現リーシュマニア原虫は得られていない.
次年度は,今年度の成果をふまえ,LACK遺伝子クローニングを行うとともに,transientな系でのLACKも,引き続き検討していきたいと考えている.