マイクロアレイを使った激症型A群溶連菌の病原因子の検索

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12770131
• Research Institution: Gifu University
• Principal Investigator: 河村 好章 岐阜大学, 医学部, 助手 (80262757)
• Keywords: マイクロアレイ / 激症型溶連菌

Research Abstract

マイクロアレイ上に固定すべき遺伝子の検索を行った.ORF予測は隠れマルコフモデルを使った方法を利用した.インターネット上で公開されているStreptococcus pyogenesのほぼ全領域の塩基配列を使い 500塩基以上のORFを主に検索した.その結果約1000種の推定ORFが存在していることが明らかとなった.これら推定ORFから一部はプライマーを設計したが,更に各種ブロテアーゼなどを規定している遺伝子を絞り込み,プライマーを設計する.既知のS.pyogenes病原遺伝子約35種については,プライマーを設計した.
細菌からのmRNAの回収方法についてはtotal RNAを回収し,ビオチン標識した16S rRNAおよび23S rRNAと混合後,アビジンコートで吸着させる方法を採用した.
スライドグラス上にDNAを確実に固定しマイクロアレイを作製する条件を検討した.DNA濃度,スホット条件(温度,湿度,時間など)等について検討し,使用可能なマイクロアレイを作ることができた.プローブDNAのラベルは蛍光プライマーを使って増幅することにより容易に導入できたが,感度がやや弱く更に検討が必要と思われた.DNA-DNA hybridizaion中の非特異反応を軽減するため種々のブロッキング剤を検討したが,メチルピロリジンが最も有効であった.