末梢神経損傷に対する遺伝子治療の基礎的研究〜生体内局所的遺伝子発現による神経再生促進効果の解析〜

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12770793
• Research Institution: Kyoto Prefectural University of Medicine
• Principal Investigator: 岡島 誠一郎 京都府立医科大学, 医学部, 助手 (70305580)
• Keywords: シナプス小胞関連蛋白 / 神経栄養因子 / PC12細胞 / GFP / リポフェクション法 / 末梢神経 / 遺伝子治療

Research Abstract

培養神経細胞および培養シュワン細胞においてシナプス小胞関連蛋白および神経栄養因子の遺伝子を導入し各遺伝子の神経伸長効果を解析し、再生軸索およびその支持機構で神経栄養因子の産生において中心的役割を果たしているシュワン細胞への遺伝子の発現効果および神経再生機構における相互作用をマーカー遺伝子に対する免疫組織化学およびウェスタンブロット法にて確認した。PC12細胞にシナプス開口分泌関連タンパク質(VAMP-2,SNAP-25A, syntaxin1A)とGFP(green fluorescent protein)の融合タンパクを発現させ神経突起の伸長効果を解析した。24時間培養したPC12細胞にGFP, GFP-VAMP-2,GFP-SNAP25A, GFP-syntaxin1Aの遺伝子をリポフェクション法を用いて導入した。導入後nerve growth factor添加培地にて72時間培養し、それぞれのタンパクを発現している50細胞において個々の神経突起長、各細胞の総神経突起長および神経突起数を計測した。また、ウェスタンブロット法にて導入したタンパクの発現を検索した。GFP-VAMP-2発現群は各神経突起長および総神経突起長においてGFP発現群に比べ有意に大きかった。一方、GFP-SNAP-25A発現群は各神経突起長では変化はなかったが、総神経突起長および神経突起数で有意に大きかった。GFP-syntaxin1A発現群については有意差を認めなかった。また、導入したタンパクの発現を全群で認めた。シナプス開口分泌関連タンパク質は小胞側にVAMP、付加する膜側にSNAP-25,syntaxinがそれぞれ存在し複合体を形成することで膜付加が可能となることが知られている。これまでにも、SNAP-25が神経突起の伸長を促進、またsyntaxin1A、VAMPは伸長に関与しているという報告はあるがいまだ不明な点も多い。今回VAMP-2およびSNAP-25A発現群ともに総神経突起長を増加させた。しかし促進様式については、VAMP-2発現群は個々の神経突起長を増加し、一方SNAP-25A発現群は神経突起数を増加することで伸長効果に寄与していると考えられた。培養シュワン細胞への遺伝子導入については現在進行中である。

Research Products

• [Publications] 白須幹啓 (Shirasu M.): "VAMP-2 promotes neurite elongation and SNAP-25A increases neurite sprouting in PC12 cells"Neuroscience Research. 37・4. 265-275 (2000)
• [Publications] 岡島誠一郎 (Okajima S.): "Ultrastructural characteristics and synaptophysin immunohistochemistry of regenerating growth cones following traumatic injury to rat peripheral nerve"Journal of Reconstructive Microsurgery. 16・8. 637-642 (2000)
• [Publications] 岡島誠一郎: "上肢の反射性交感神経性ジストロフィーの治療法の検討"日本手の外科学会誌. 17・6. 648-652 (2001)
• [Publications] 平澤泰介 (Hirasawa Y.): "Nerve distribution to the human knee joint : anatomical and immunohistochemical study"International Orthopaedics. 24. 1-4 (2000)
• [Publications] 玉井幹人 (Tamai M.): "Quantitative analysis of neural distribution in human coracoacrominal ligaments"Clin Orthop Rel Res. 373. 125-134 (2000)
• [Publications] 平澤泰介: "末梢神経再生、先端医療シリーズ8・整形外科, 診断と治療の先端"先端医療技術研究所. 7 (2000)