アルカリフォスファテース遺伝子導入によるう蝕原性細菌の人為的石灰化法の開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12771145
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 大原 直子 長崎大学, 歯学部, 助手 (80301365)
• Keywords: アルカリフォスファテース / 細菌 / う蝕 / 石灰化

Research Abstract

大腸菌にアルカリフォスファテース遺伝子(phoA遺伝子)を導入しその酵素活性を人為的に上昇させ、適当な条件下で培養すると石灰化が生じることは、既に明らかにしている。そのシステムを齲蝕原性細菌に応用することを目的として、以下の実験を行った。齲蝕原性細菌として、Streptococcus mutansと乳酸菌(lactococcus lactis)を用いた。
1、石灰化条件に関する検討
大腸菌の場合、長期間連続培養しても培地のpH低下は問題とならなかったが、S.mutansや乳酸菌を培養したところ、菌の増埴とともに培地pHが低下した。S.mutansをBHI培地で24時間培養した場合、pHは4まで低下していた。石灰化を考える場合、結晶の安定性からpHは中性以上に保たれる必要がある。齲蝕原性細菌は、酸を多く産生するのものがほとんどである。pHの条件を整えるために何らかの工夫が必要であることが明らかとなった。
2、乳酸菌のphoA遺伝子のクローニング
乳酸菌では、PhoAの存在および配列に関する報告がないため、他の菌種間で保存されている領域のアミノ酸配列をもとにプライマーを設計し、PCRを行った。その結果、期待される約140bpの位置にバンドを得ることができた。このDNA断片をプローブとして用い、染色体から遺伝子クローニングを行なっている。
3、S.mutansの強力なプロモーターの検索
S.mutansから外来の遺伝子を発現させるにあたり、強力なプロモーターの検索が必要となる。大腸菌-連鎖球菌シャトルベクター(pHTet30)に、S.mutansの遺伝子断片とレポーター遺伝子として大腸菌のphoA遺伝子を挿入した。その発現量をマーカーに、現在スクリーニング中である。