in situ PCR法による細菌病原遺伝子の検出法の開発と臨床診断への応用

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12771275
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 佐藤 順子 (松山 順子) 新潟大学, 歯学部附属病院, 助手 (30293236)
• Keywords: PCR / 歯周病関連細菌 / 齲蝕関連細菌

Research Abstract

前年度までの科学研究費補助金研究によって、PCR法を用いた口腔細菌の同時検出法、いわゆる、Multiplex PCR法の開発研究を行なったが、対象が臨床試料中の細菌DNAであり、そのtemplate濃度が僅少となるため、実用化は難しい状況であった。そこで、本年度の研究では、その難点を克服すべく、universal primersによるPCR産物をtemplateとして用いて、菌種特異的PCRを行ない、Nested multiplex PCR法を開発した。歯周ポケット15例から内容液を採取後、試料中の細菌DNAを抽出し、universal primers(8UAと1492R)で16Sribosomal RNA遺伝子をPCR増幅し、カラム精製後のPCR産物をtemplateとして、歯周病関連細菌(Porphyromonas gingivalis,Actinobacillus actinomycetemcomitans,Prevotella intermedia,Prevotella nigrescens,Bacteroides forsythus,Treponema denticola,Treponema socranskii,Treponema vincentii)に特異的なprimersによるPCR増幅(NestedPCR)を行なった。その結果、Nested PCR全例において、標準的なPCR増幅より有意にPCRpositiveな試料が増加し、この傾向はNested multiplex PCR法においても同様に見られた。本研究によって、菌種特異的なprimersによる細菌病原遺伝子の同時検出(Multiplex)ならびにin situ PCRの基礎的データが得られた。引き続き、増幅対象を線毛や毒素、酵素など他の病原遺伝子に広げ、更に臨床試料対象を歯垢や唾液、齲蝕象牙質にまで広げて、基礎実験を進めている。

Research Products

• [Publications] Matsuyama(Sato)J.: "Comparison between PCR-RFLP and biochemical analyses for identifica-tion of Actinomyces"Journal of Dental Research. 80巻(印刷中). (2001)
• [Publications] Matsuyama(Sato)J.: "Comparison between 16S rRNA genes PCR-RFLP analysis and biochemical tests for identification of Actinomyces naeslundii"International Journal of Oral Biology. 20巻3号. 83-86 (2000)
• [Publications] Sato T.: "Rapid identification of oral mutans streptococci by 16S rRNA genes PCR-RFLP"Journal of Dental Research. 80巻(印刷中). (2001)
• [Publications] Sato T.: "16S rRNA genes PCR-RFLP analysis for rapid identification of oral anaerobic gram-positive bacilli"International Journal of Oral Biology. 25巻3号. 87-91 (2000)
• [Publications] 佐藤拓一: "歯周病関連グラム陰性桿菌のPCR-RFLPによる迅速同定法"歯科基礎医学会雑誌. 42巻5号. 511 (2000)
• [Publications] Sato T.: "Rapid detection of periodontal pathogens by multiplex PCR"Journal of Dental Research. 79巻. 396 (2000)