2000 Fiscal Year Annual Research Report
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12771456
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
上田 敦久 横浜市立大学, 医学部, 助手 (60295483)
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| Keywords | クロモドメイン / アンキリンリピート / 細胞周期 |
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| Research Abstract |
新規クロモドメイン蛋白Chromodomain/Ankirin repeat Protein(CHANP)p95遺伝子の単離、及び産物CHAMPの解析を行った。まず、C末端155anino acidsをpET systemを用いてHis-tagged recombinant proteinとして大腸菌で発現、可溶分画よりニッケルカラムを用いて精製した。これをKLHアジュバントと共に数回兎に免疫し、血清をアフィニテイカラムに通してaffinity purified IgGとした。抗体の特異性を確認するためHela cell extractを用いてImmunoblottを行ったところ分子量130kDの位置に特異性の高い単一バンドが検出された。この抗体を用いてCHAMPの細胞内局在を調べたところ。間期には核内にdiffuseに局在し、分裂期に細胞質に局在することが判明した。核内の局在はCHAMPをGFPとのfusion proteinとして発現させた場合も同様の核内の局在として確認された。次にその機能解析を行うため完全長型、クロモドメイン欠損型、アンキリン配列欠損型を発現するアデノウイルスベクターを作成し、正常2倍体ラット肝細胞ARLJ301-3に過剰発現させた。アンキリン配列欠損型を過剰発現させた細胞では細胞周期においてM期の延長を認めドミナントネガティブ効果と考えられた。Thymedine uptake,アポト.シスの誘導性に関してはコントロールAd-βGalと差を認めなかった。CHAMPがM期においていかなる様式でその機能を発現するのか、現在Yeast two hybridを用いた結合蛋白の単離、Xenopusの系をもちいての解析を行っている。
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