2001 Fiscal Year Annual Research Report

DNAポリメラーゼβとその新規特異的阻害天然物の結合の立体構造的研究

Research Project

Project/Area Number	12780442
Research Institution	Kobe Gakuin University
Principal Investigator	水品善之神戸学院大学, 栄養学部, 講師 (20307705)
Keywords	酵素特異的阻害剤 / DNAポリメラーゼβ / 長鎖脂肪酸 / リトコール酸 / 糖脂質 / 2次元NMR解析 / 立体構造解析
Research Abstract	1.DNAポリメラーゼβ・8kDaドメインの大量発現 DNAポリメラーゼβ(polβ)・8kDaドメイン遺伝子のN末側にHis-タグを挿入して、その遺伝子を大腸菌へ組み込んだ。そして大腸菌を培養して遺伝子を発現させて、ニッケルカラムで簡単にかつ大量に8kDaドメインを供給することに成功した。培地に^<15>NH_4Clを添加して蛋白質を安定同位体ラベルすることにより、2次元NMR測定用の8kDaドメインサンプルを提供できるようにした。 2.DNAポリメラーゼβ・8kDaドメインと阻害剤の2次元HMQC-NMR解析長鎖脂肪酸のリノール酸およびネルボン酸、胆汁酸ステロイドであるリトコール酸がpolβ・8kDaドメインの一本鎖DNA結合活性を阻害したので、阻害剤の8kDaドメインへの結合を^1H-^<15>N HMQC-NMRで解析した。長鎖脂肪酸は8kDaドメインのLeu11,Lys35,His51,Thr79と、リトコール酸はLys60,Leu77,Thr79と結合することを見いだした。長鎖脂肪酸・リトコール酸ともにカルボキシル基を有しており、カルボキシル基がLys残基と水素結合することが考察された。 3.糖脂質(Sulfo-quinovosyl-monoacyl-glycerol, SQMG)の化学合成長鎖脂肪酸よりも10倍以上強くpolβを阻害する糖脂質(SQMG)の有機化学合成に成功した。また各種類似体・誘導体合成にも成功して、阻害剤の構造活性相関を明らかにした。SQMGと8kDaドメインの結合のNMR解析を現在実施している。 4.DNAポリメラーゼβ・8kDaドメインの変異蛋白質の作製遺伝子工学的手法を用いて、長鎖脂肪酸およびリトコール酸が結合する上述の8kDaドメインのアミノ酸残基をAlaに変異させた蛋白質の作製に成功した。阻害剤の変異蛋白質への結合について、野生型(非変異型)との比較はこれから実施するところである。

Research Products

(8 results)

All Other

All Publications (8 results)

[Publications] Y.Mizushina et al.: "Structure of lithiocholic acid binding to the N-terminal 8-kDa domain of DNA polymerase β"Biochemistry. 39. 12606-12613 (2000)
[Publications] Y.Mizushina et al.: "Mode analysis of binding of fatty acids to mammalian DNA polymerases"Biochim.Biophys.Acta. 1486. 211-218 (2000)
[Publications] S.Hanashima et al.: "Structure-activity relationship of a novel group of mammalian DNA polymerase inhibitors, synthetic sulfoquinovosylacylglycerols"Jpn.J.Cancer Res.. 91. 1073-1083 (2000)
[Publications] S.Hanashima et al.: "Structure determination of sulfoquinovosyldiacylglycerol by chiral syntheses"Tetrahedron lett.. 41. 4403-4407 (2000)
[Publications] Y.Mizushina et al.: "Galactosyldiacylglycerol, a mammalian DNA polymerase α-specific inhibitor from a sea alga. Petalonia bingbamiae"Biol.Pharm.Bull.. 24・9. 982-987 (2001)
[Publications] Y.Mizushina et al.: "Three-dimensional structural model analysis of the binding site of lithocholic acid, an inhibitor of DNA polymerase β and DNA topoisomerase II"J.Biochem.(Tokyo). 130. 657-664 (2001)
[Publications] S.Hanashima et al.: "Synthesis of sulfoquinovosylacylglycerols, inhibitors of eukaryotic DNA polymerase α and β"Bioorg.Med.Chem.. 9. 367-376 (2001)
[Publications] M.Watanabe et al.: "Biotinylated lithocholic acids for affinity chromatography of mammalian DNA polymerase α and β"Bioorg.Med.Chem.Lett.. (in press). (2002)

2001 Fiscal Year Annual Research Report

DNAポリメラーゼβとその新規特異的阻害天然物の結合の立体構造的研究

Principal Investigator

水品 善之 神戸学院大学, 栄養学部, 講師 (20307705)

Research Products

[Publications] Y.Mizushina et al.: "Structure of lithiocholic acid binding to the N-terminal 8-kDa domain of DNA polymerase β"Biochemistry. 39. 12606-12613 (2000)

[Publications] Y.Mizushina et al.: "Mode analysis of binding of fatty acids to mammalian DNA polymerases"Biochim.Biophys.Acta. 1486. 211-218 (2000)

[Publications] S.Hanashima et al.: "Structure-activity relationship of a novel group of mammalian DNA polymerase inhibitors, synthetic sulfoquinovosylacylglycerols"Jpn.J.Cancer Res.. 91. 1073-1083 (2000)

[Publications] S.Hanashima et al.: "Structure determination of sulfoquinovosyldiacylglycerol by chiral syntheses"Tetrahedron lett.. 41. 4403-4407 (2000)

[Publications] Y.Mizushina et al.: "Galactosyldiacylglycerol, a mammalian DNA polymerase α-specific inhibitor from a sea alga. Petalonia bingbamiae"Biol.Pharm.Bull.. 24・9. 982-987 (2001)

[Publications] Y.Mizushina et al.: "Three-dimensional structural model analysis of the binding site of lithocholic acid, an inhibitor of DNA polymerase β and DNA topoisomerase II"J.Biochem.(Tokyo). 130. 657-664 (2001)

[Publications] S.Hanashima et al.: "Synthesis of sulfoquinovosylacylglycerols, inhibitors of eukaryotic DNA polymerase α and β"Bioorg.Med.Chem.. 9. 367-376 (2001)

[Publications] M.Watanabe et al.: "Biotinylated lithocholic acids for affinity chromatography of mammalian DNA polymerase α and β"Bioorg.Med.Chem.Lett.. (in press). (2002)

水品善之神戸学院大学, 栄養学部, 講師 (20307705)