オーダーメイド型人工制限酵素・人工リプレッサーの開発

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12793008
• Research Institution: KYOTO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 杉浦 幸雄 京都大学, 化学研究所, 教授 (40025698)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 永岡 真 京都大学, 化学研究所, 助手 (60314275) ; 五斗 進 京都大学, 化学研究所, 教授 (40263149) ; 二木 史朗 京都大学, 化学研究所, 助教授 (50199402)
• Keywords: 亜鉛フィンガー / 遺伝子ターゲット / 人工タンパク質 / 人工制限酵素 / 人工リプレッサー / DNA湾曲 / DNA認識 / DNAモチーフ

Research Abstract

(1)転滋因子Sp1の3つの亜鉛フィンガーを1ユニットとし、2ユニットつなげた6フィンガータンパク質を創製し、目的配列への結合を評価した。(2)ユニット間のリンカーの長さを変えた数種の6フィンガータンパク質をデザインし、GCボックスの相対位置を変えた同じ長さ・塩基組成のDNAフラグメントを用いて、ゲルシフト法によりDNA-タンパク質複合体の移動度の違いを解析することにより、DNAの湾曲の位置と程度を特定した。(3)Sp1のどの部分がDNAの湾曲を引き起こすのかを明らかにするために、Sp1のアミノ酸を改変または除去し、ゲルシフト法、フツトプリント法、干渉法などを利用して、改変前後の変化について検討した。(4)Sp1のフィンガー2における位置にCF2のフィンガー5で見られるアミノ酸V、Y、Kをそれぞれ導入したSp1-亜鉛フィンガー変異体(Sp1VYK2)やSp1とCF2のキメラ亜鉛フィンガー蛋白質など、p53や核受容体結合部位をもつ新しいAT認識型の亜鉛フィンガー蛋白質の分子設計を行ない、大腸菌中で発現させ、HPLCで高純度に精製した。得られた蛋白質を用いて、5'-GGG-TAT-GGG-3'のようなDNA配列への高選択的結合能などを評価した。任意の塩基配列の認識が可能となるような亜鉛フィンガーをSAAB法により探索した。以上の知見を基に、DNAの湾曲とSp1による転写との関係をSp1の変異体を用いたCATアッセイにより追究し、DNA湾曲を利用した特定遺伝子の転写および発現の人為的制御を細胞レベルで試みた。

Research Products

• [Publications] M.Imanishi: "Artificial DNA-Bending Six-Zinc Finger Peptides with Different Charged Linkers : Distinct Kinetic Properties of DNA Bindings"Biochemistry. 41・4. 1328-1334 (2002)
• [Publications] M.Nagaoka: "Novel Strategy for the Design of a New Zinc Finger : Creation of a Zinc Finger for the AT-Rich Sequence by α-Helix Substitution"J. Am. Chem. Soc.. 124・23. 6526-6527 (2002)
• [Publications] M.Nagaoka: "Influence of amino acid numbers between two ligand cysteines of zinc finger proteins"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 296・3. 553-559 (2002)