心・血管系における新たな小胞体のカルシウム制御機能の解析

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12835009
• Research Institution: Yamaguchi University
• Principal Investigator: 木村 佳弘 山口大学, 医学部, 講師 (90301308)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高 知愛 山口大学, 医学部, 助手 (70314797) ; 山田 康枝 山口大学, 医学部, 助手 (00166737) ; 乾 誠 山口大学, 医学部, 教授 (70223237)
• Keywords: 心筋 / 血管平滑筋 / 小胞体 / カルシウムATPase / ホスホランバン

Research Abstract

ホスホランバンは心筋小胞体Ca^<2+>-ATPase(SERCA2a)及びその血管平滑筋のisoformであるSERCA2b活性を可逆的に抑制することにより、心筋においては収縮力と弛緩速度を、血管平滑筋においては血管トーヌスを調節していると考えられている。この調節は細胞質ドメインと小胞体膜内へリックスの少なくとも2箇所の直接蛋白質間相互作用を介してなされている。したがって、心血管系の機能調節を理解するにはこの相互作用の解析が必須である。また、この相互作用を阻害することにより、心筋収縮力と拡張能を改善し、血管抵抗を低下させる新しい心不全治療薬を開発できる可能性がある。本年度はまず、SERCA2とホスホランバンの細胞質ドメインの部分ペプチドによる再構成系を用いて蛋白質間相互作用様式の基礎的検討を行うとともに、両蛋白質間相互作用を評価するアッセイ系を開発した。
SERCA2の燐酸化部位及びATP結合部位を含む細胞質ドメイン(331-726)の融合蛋白質とホスホランバンの細胞質ドメインの部分ペプチド(1-26)の融合蛋白質を作製した。さらに、ホスホランバンの燐酸化部位のSer,ThrをAspに置換した変異体を作成し、これらホスホランバン融合蛋白質とSERCA2細胞質ドメイン融合蛋白質との結合を検討した。さらに、ELISA plateを用いたアッセイ系を作成した。
ホスホランバン融合蛋白質はSERCA2細胞質ドメイン融合蛋白質と特異的に結合した。ホスホランバン燐酸化及び燐酸化部位のAspへの変異はこの結合を抑制した。以上より、ホスホランバンとSERCA2の細胞質内相互作用は部分ペプチドによって再構成することができ、この結合には膜内ドメインを必要としないことが明らかとなった。両蛋白質の細胞質ドメイン同士の結合はホスホランバンのSERCA2抑制機能を反映すると考えられる。

Research Products

• [Publications] Zhai,J.: "Cardiac-specific overexpression of a superinhibitory pentameric phospholamban mutant enhances inhibition of cardiac function in vivo."J.Biol.Chem.. 275・14. 10538-44 (2000)
• [Publications] Zvaritch,E.: "The transgenic expression of highly inhibitory monomeric forms of phospholamban in mouse heart impairs cardiac contractolity."J.Biol.Chem.. 275・20. 14985-91 (2000)