放線菌によるリグニン関連芳香族化合物の代謝及び微生物変換に関する基礎研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12875159
• Research Institution: Ube National College of Technology
• Principal Investigator: 西村 基弘 宇部工業高等専門学校, 物質工学科, 助教授 (30259931)
• Keywords: リグニン / 放射菌 / バニリン酸 / 脱メチル化 / 遺伝子

Research Abstract

本年度は、低分子リグニン資化性放線菌NL15-2K株より、その基幹代謝経路の一つであるバニリン酸脱メチル化酵素(VDM)遺伝子のクローニングと当該遺伝子の解析を行った。具体的には以下を実施した。
1.NL15-2K株の染色体DNAライブラリーの作製とVDM遺伝子のクローニング
2.放線菌宿主-ベクター系を用いたVDM遺伝子の発現
3.VDM遺伝子クラスターの解析
1については、ファージベクターを用いて染色体DNAライブラリーを構築し、昨年度設計したVDM遺伝子特異的プローブを用いて当遺伝子のスクリーニングを行った。その結果、プローブと特異的に結合する約14.5kb DNA断片の取得に成功した。
2については、1で得た断片をプラスミドベクターpIJ702にサブクローニングし、放線菌宿主Streptomyces lividans 1326に導入した。こうして得たクローンのうち、上記プローブとハイブリダイズする組み換えプラスミドpVDMを含む細胞はVDM活性を発現することが確認された。また、pVDMより作製したディレーションミュータントについてVDM活性を調べた結果、その発現には少なくとも2.7kbからなる領域(VDM遺伝子)が必要であることが判明した。
3については、VDM遺伝子を含む約7.5kbの核酸塩基配列を解析した。塩基配列決定後、オープンリーディングフレーム(ORF)の検索を行ったところ、少なくとも3つのORF(A-C)が見出された。このうちVDM遺伝子を構成するORF A及びBより導かれるアミノ酸配列は、それぞれPseudomonas sp. HR199,Ps. sp. ATCC19151のVan A及びVan Bと36%,41.6%の相同性を示した。これらのタンパクは、PseudomonasにおいてVDMを構成する2つのサブユニットであった。また、ORF Cよりコードされるタンパクについては、Rhodococcus由来のプロトカテク酸代謝調節遺伝子pca Rと57%の相同性を有していた。
以上の成果は、前年度の成果と合わせて下記にて発表した。
(1)International Symposium on the Biology of Actinomycetes(2001),Canada, Abstract Book p89
(2)平成13年度日本生物工学会大会 要旨集p251