C型肝炎に対するDNAリボヌクレアーゼによる遺伝子治療法の開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12877087
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 桶谷 真 鹿児島大学, 医学部・附属病院, 助手 (50274816)
• Keywords: C型肝炎ウイルス / DNAリボヌクレアーゼ / 遺伝子治療 / 非ウイルスベクター

Research Abstract

現在、C型肝炎ウイルス(HCV)の5′非翻訳領域以外のDNAリボヌクレアーゼ標的領域を調べるため、標的となるHCV各領域の遺伝子断片を含むルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターを遺伝子組み換え法にて構築中である。また最適なDNAリボヌクレアーゼコンプレックス作製の予備的研究を行った。化学的に調製したアシアロ糖蛋白-ポリリジン(ASOR-PLL)およびポリエチレングリコール化PEI(PEG-PEI)を用い、DNAリボヌクレアーゼと混合し、アガロースゲル電気泳動によりフリーおよびコンプレックス化DNAリボヌクレアーゼの割合を調べた。これによると、コンプレックス化の最適な比率はおおよそDNAribonuclease:PEG-PEI:ASOR-PLL=1:0.7:2.3であった。HCVの5'非翻訳領域からコア領域を標的とするDNA ribonuclease(Dz2-15-15-end)およびcontrol(Dz sense 4-15-15)を用い先の割合でDNAリボヌクレアーゼコンプレックスを作製した。標的領域を挿入したルシフェラーゼ遺伝子発現ベクター(pCMV-luc CΔ2)を遺伝子導入したHuH7肝癌細胞株培養液中にヒト血清の存在下でこれらを加え、経時的にルシフェラーゼ遺伝子の発現抑制効果をDual-Luciferase Assay法にて測定した。その結果、1μMのDz2-15-15-endではcontrolに対して約40%の発現抑制効果をみとめた。現在、より安定で効果的なDNAリボヌクレアーゼコンプレックスの作製法を検討中である。