2001 Fiscal Year Annual Research Report
土壌細菌DNAの総観的分子分類解析による環境診断法の開発
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12878086
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| Research Institution | Yokohama National University |
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Principal Investigator |
伊藤 公紀 横浜国立大学, 大学院・環境情報研究院, 教授 (40114376)
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| Keywords | 土壌細菌 / 16SリボソームDNA / DNA / 鎖長多型 / PCR / PCRプライマー / DNA抽出 / 活性汚泥 |
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| Research Abstract |
1.弱選択性PCRプライマーの設計 土壌細菌を数個のサブグループに分けるPCRプライマーの詳しい設計を行った。既知のユニバーサルプライマーの末端に2塩基追加することで選択性を得ることができた。しかし、最末端塩基が同じであると、選択性が悪くなることが判明した。フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせにより、細菌を3種(紅色細菌α・δ、紅色細菌β・γ、グラム陽性細菌)に分けるパターンと、8種(紅色細菌β、紅色細菌γ、フレキシバクター、など)に分けるパターンを得ることができた。純粋培養の細菌から抽出したDNAの混合物を用いて選択性を調べ、意図したDNA断片が得られることが確認できた。
2.細菌DNA抽出・精製法の検討 前年度の検討に加え、液体窒素法等、新たに幾つかのDNA抽出法を検討に加えた。得られたDNAの鎖長分布から、液体窒素法はDNAの変性が少ない手法であることが分かった。ビードビーターを用いた機械的溶菌手法も、鎖長分布は良好であった。フェノール抽出と機械的溶菌を組み合わせた手法では、全核酸収量は多いものの、DNAの切断がかなり起こっていると判断された。
3.土壌細菌DNAの鎖長多型解析 16SリボソームDNAの変化域をデータベースに基づいて詳しく調べ、変化域Iの鎖長多型の程度が最も大きいことが分かった。これに対して、濃度勾配ゲル電気泳動法による多型解析で頻用される変化域IIIは鎖長多型度が小さい。この結果に基づいて、種々の季節に採取した数種の土壌から得た細菌DNAの鎖長多型解析を行った。その結果、夏季の土壌細菌パターンが単純なこと、秋季・冬季には多様性が増すことが分かった。また、畑土壌の細菌パターンは森林土壌に比べて単純であった。また、この手法の応用として、活性汚泥細菌にDNA鎖長多型解析を適用した。
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