細菌の細胞膜間糖輸送過程に関与する酵素フリッパーゼの実体の解明

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12878109
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 古山 種俊 東北大学, 反応化学研究所, 教授 (20089808)
• Keywords: フリッパーゼ / フリップ-フロッブ / 細菌細胞壁生合成 / ウンデカプレニルニリン酸 / ペプチドグリカン / 糖タンパク質生合成 / ドリコールリン酸 / プレニルトランスフェラーゼ

Research Abstract

まず最初に手掛ける目標として、細菌の細胞壁生合成において細胞質側で合成されたオリゴ糖成分をフリップ-フロップ移送により細胞外膜側に輸送する動的な過程に関与するとされ、その存在が教科書にも予想され、記述されているにもかかわらず、全く実体が把握されていない酵素「フリッパーゼ」の酵素活性測定法の確立のために、蛍光プローブの合成法を検討した。まず、大量発現系を構築しているウンデカプレニルニリン酸合成酵素を用いてウンデカプレニルリン酸の大量合成系を確立した。次にウンデカプレニルリン酸にスペーサーを介して蛍光試示薬を付加させる条件検討を行い、一応目的とする蛍光プローブの合成ルートを見出すことが出来た。現在、さらにこのプローブの大量合成ルートの確立を検討中である。
一方、ウンデカプレニルニリン酸合成酵素のX線結晶構造解析を進めた結果、2.2Åの分解能での立体構造解明に成功した。興味深いことにこの酵素は今までに例を見ない全く新規な折り畳み構造を有するタンパク質であることがわかった。この酵素の基質の結合部位を部位特異的変異導入実験と結晶構造の詳細な解析により決定した。
ヒトのデヒドロドリキルニリン酸合成酵素をコードしていると予想されるcDNAをクローン化した。現在発現系の構築を行って、クローン化した遺伝子産物の酵素活性を確認することで、ヒトの糖タンパク生合成系のフリッパーゼの探索研究の糸口を見出そうと努力しているところである。

Research Products

• [Publications] M.Nagaki,S.Sato,Y.Maki,T.Nishino,and T.Koyama: "Artificial Substrates for Undecaprenyl Diphosphate Synthase from Micrococcus luteus B-P 26"J.Mol.Catal.. 9・1-3. 33-38 (2000)
• [Publications] T.Koyama,Y.Gotoh,and T.Nishino: "Intersubunit Location of the Active Site of Farnesyl Diphosphate Synthase-Reconstitution of Active Enzymes by Hybrid-type Heteromeric Dimers of Site-Directed Mutants"Biochemistry. 39・2. 463-469 (2000)
• [Publications] M.Nagaki,A.Takaya,Y.Maki,J.Ishibashi,Yoko Kato,T.Nishino,and T.Koyama: "One-pot Syntheses of the Sex Pheromone Homologs of a Codling Moth, Laspeyresia promonella L."J.Mol.Catal.B ; Enzymatic. 10. 517-522 (2000)
• [Publications] Y.-W.Zhang,Y.Kharel,and T.Koyama: "Overexpression, Purification, and Characterization of Selenomethionyl Farnesyl Diphosphate Synthase of Bacillus stearothermophilus"J.Mol.Catal.B.. 10. 623-630 (2000)
• [Publications] K.Hirooka,S.Ohnuma,A.Kolke-Takeshita,T.Koyama,and T.Nishino: "Mechanism of Product Chain Length Determination for Heptaprenyl Diphosphate Synthase from Bacillus Stearothermophilus"Eur.J.Biochem. 267・14. 4520-4528 (2000)
• [Publications] Y.-W.Zhang,X.-Y.Li,and T.Koyama: "Chain Length Determination of Prenyltransferases : Both Heteromeric Subunits of Medium-Chain (E)-Prenyl Diphosphate Synthase are Involved in the Product Chain Length Determination"Biochemistry. 39. 12717-12722 (2000)
• [Publications] K.Fujikura,Y,-W.Zhang,H.Yoshizaki,T.Nishino,and T.Koyama: "Significance of Asn-77 and Trp-78 in the Catalytic Function of Undecaprenyl Diphophate Synthase of Micrococcus luteus B-P 26"J.Biochem.. 123. 917-922 (2000)
• [Publications] N.Ohya,Y.Tanaka,R.Wititsuwannakul,and T.Koyama: "Activity of Rubber Transferase and Rubber Particle Size in Hevea Latex"J.Rubber Research. 3・4. 214-221 (2000)
• [Publications] M.Nagaki,S.Sato,Y.Maki,T.Nishino,and T.Koyama: "An Artificial Substrate for Undecaprenyl Diphosphate Synthase from Micrococcus luteus B-P 26"Catal, Commun.. 1・1. 33-35 (2001)
• [Publications] M.Fujjihashi,Y.-W.Zhang,Y.Higuchi,X.-Y.Li,T.Koyama,and K.Miki: "Cryatal Structure of cis-Prenyl Chain Elongating Enzyme, Undecaprenyl Diphosphate Synthase"Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.. (in press).
• [Publications] N.Ohya and T.Koyama: "Chapter 4.Biosynthesis of Natural Rubber and Other Natural Polyisoprenoids"Biopolymers, Volume 2, Polyisoprenoids, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, T.Koyama and S.Steinbuhel eds., in press..
• [Publications] Y.-W.Zhang and T.Koyama: "Chapter 5.Biosynthesis Routes Diverting from Intrmediates of Polyisoprenoid Biosynthesis to Related Products of the Metabolism"Biopolymers, Volume 2, Polyisoprenoids, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, T.Koyama and S.Steinbuhel eds., in press..