リボザイム誘導システムを具備する細胞・個体レベルの遺伝子発現調節実験系の開発

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12878162
• Research Category: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• Research Institution: Central Institute for Experimental Animals
• Principal Investigator: 水島 友子 財団法人実験動物中央研究所, 研究プロジェクト推進センター, 研究員 (90311240)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山崎 等 東海大学, 医学部, 講師 (20191273)
• Keywords: Ribozyme / Tetracyclin / Inducible System / mice / Transgenic / Insulin / Min-6

Research Abstract

マウスのインスリン遺伝子をターゲットとした、5種類のアンチーマウスインスリン人工リボザイムを構築した。恒常的発現系、及び、誘導発現系それぞれの発現ベクターに組み込んだリボザイムをインスリン分泌細胞Min-6に導入し、導入細胞をクローニングした。細胞のインスリン分泌量の変化によりリボザイム活性を判定するため、EIA(Enzyme Immuno Assay)法により細胞培養液内のインスリンを測定した。これにより、リボザイム導入細胞のインスリン分泌量が非導入細胞に比べて、抑制されていることが示唆されるデータが得られた。
また、リボザイムと基質のみをin vitroで反応させる、in vitro cleavage assayにより、少なくとも構築したうち一種類についてin vitroでのリボザイム活性を確認した。
一方、動物個体内で発現調節系を作動させるため、マイクロインジェクションによりテトラサイクリン誘導システム及びレポーター遺伝子(Luciferase)を組み込んだトランスジェニック(Tg)マウスの作製を開始し、5ラインのTgマウス及びこれらをC57BL/6J Jclマウスと交配したF1マウスが数十匹得られた。
また、トランスジーンの導入を確認するPCRシステム、及び、トランスジーンからの目的分子の発現を確認するための実験系(酵素反応系、ウエスタン、ノーザンブロッティング)を、構築、最適化した。現在、これらの実験系を用いてF1マウスでのトランスジーンの発現状態を解析中。
目的にかなったダブルTgマウスが得られれば、テトラサイクリンによる遺伝子誘導発現系が動物個体内で作動することを確認する予定である。