2013 Fiscal Year Annual Research Report
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12J03979
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
林 真妃 名古屋大学, 大学院理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Keywords | 気孔孔辺細胞 / 細胞膜H^+-ATPase / 免疫組織染色 / キナーゼ阻害剤 |
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| Research Abstract |
植物の表皮に存在する気孔は、青色光によって開口し、二酸化炭素の取り込みや蒸散を調節する。青色光が気孔孔辺細胞に照射されると、フォトトロピンが青色光を受容してシグナルを伝達し、細胞膜H^+-ATPaseを活性化して気孔が開口する。H^+-ATPaseの活性化にはC末端のリン酸化が重要であるが、このリン酸化を直接触媒するプロテインキナーゼは未知であり、また、フォトトロピンからH^+-ATPaseのリン酸化に至るシグナル伝達の詳細も不明である。そこで本研究では、この未知の部分を解明するため、特にプロテインキナーゼに着目して気孔開口のシグナル伝達を仲介するタンパク質の探索・同定を進めている。
私はこれまでに、孔辺細胞のH^+-ATPaseのリン酸化を免疫組織染色により可視化する手法を確立している。今年度はこの手法を用い、H^+-ATPaseのリン酸化を抑制する阻害剤をキナーゼ阻害剤ライブラリー80種から選抜した。その結果、4種が青色光によるリン酸化を阻害した。また、H^+-ATPaseの活性化剤フシコクシンとキナーゼ阻害剤を合わせて処理し、H^+-ATPaseを直接リン酸化するキナーゼを阻害すると考えられる阻害剤を4種選抜した。
阻害剤の標的は動物のプロテインキナーゼであるため、シロイヌナズナにおける標的を相同性検索により絞った。その結果、選抜した8種のうち5種の阻害剤が、シロイヌナズナのMAPKKKファミリーを標的としている可能性が示された。そこで、シロイヌナズナゲノムに60遺伝子存在するMAPKKKの中から、クレードごとに遺伝子破壊株を入手し、それらの変異株の気孔応答を観察した。その結果、青色光に応答した気孔開口が完全に損なわれていた変異株を1株単離することに成功した。従って、この遺伝子がコードするMAPKKKが気孔開口を仲介する有力候補であると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、阻害剤を用いた気孔開口を仲介するプロテインキナーゼの探索が終了し、有力候補を絞り込むところまで進めることができた。この候補因子の変異株では気孔開口が損なわれていたため、研究目的である気孔開口シグナル伝達因子の同定に成功したと考えられる。今後細かなデータを押さえる必要はあるが、現段階では順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、候補因子の変異株を用いて、孔辺細胞のH^+-ATPaseのリン酸化を免疫組織染色により調べ、フォトトロピンからH^+-ATPaseをつなぐプロテインキナーゼであるか明確にする。同時に過剰発現株も作製し、同様の解析を進める。また、既に報告されている気孔開ロシグナル伝達因子との物理的相互作用を調べ、シグナル伝達上の関係性を明らかにする。さらに、このキナーゼの機能は未だ報告されていないため、植物体での発現パターンや細胞内局在も解析し、この因子の基本特性を明らかにする。
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