酵素免疫測定法の高感度化を目的とした分子シンクロナイゼーション系の構築と応用

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13022236
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
• Keywords: 分子シンクロナイゼーション / 分子間相互作用 / 表面プラズモン共鳴法 / 生理活性アミン / 酵素免疫測定法 / ヒスタミン / 食中毒 / 臨床診断

Research Abstract

ヒスタミン(HA)は生理活性アミンとして毛細血管拡張、アレルギー反応の誘起などの生理的作用を示す。我々は肌の生体内における局在性、食品中HA高感度酵素免疫測定法構築を目的として、抗HAモノクローナル抗体(A2,IgG1)を調製した。本研究では、A2とHAとの相互作用、A2とHA類縁物質との交差反応性を表面プラズモン共鳴法(SPR ; BIAcore 2000)による分子シンクロナイゼーション系を用いて検討した。HAのアミノ基とウシ血清アルブミン(BSA)のアミノ基をグルタルアルデヒド(GA)を介して架橋したHA-GA-BSA複合体(HAC)を抗原としてマウスに免疫してA2を得た。HACには1分子BSAあたり10分子のHAが共有結合的に付加されていた。A2抗体をセンサーチップCM5にアミンカップリング固定し、A2との相互作用を解析した。pH7.4,25℃におけるA2とHACとの結合速度定数(k_<on>)は5.0×10^4M^<-1>s^<-1>、解離速度定数(k_<off>)は4.8×10^<-4>s^<-1>、解離定数(K_d)は9.6nMと求められた。A2-HAC形成の標準自由エネルギー変化(ΔG°)、標準エンタルピー変化(ΔH°)、標準エントロピー変化(ΔS°)は、それぞれ-45.2kJ・mol^<-1>、-21.3kJ・mol^<-1>,80.2J・mol^<-1>・K^<-1>であり、ΔG°にはΔH°とΔS°が同程度に寄与していた。HA類縁物[α-Me-HA、α-Me-D, L-His、1-Me-HA、3-Me-HA、L-His、γ-Aminobutyric acid(GABA)]とA2を混合した後、チップに固定化したHACに対するA2との相互作用をSPR解析した。A2とHACの結合は、HA、α-Me-HA、α-Me-D, L-His、1-MeHA、3-Me-HAの存在下に抑制され、これら5種類化合物はA2と交差反応性を示した。A2とHACの結合を50%阻害する各濃度(IC_<50>)は0.66、1.6、3.1、7.5、12mMと求められた。A2とHACとの結合に比べ、HAとの結合は7万倍も弱い。これはA2がHAのみならず、HAとGAとの結合部位付近をも認識しているためと考えられた。L-HisとGABAは>200mMでもA2とHACとの結合を阻害せず、A2とL-HisおよびGABAとの交差反応は実質的に認められなかった。今後、HAに対する選択性を上昇させる工夫が要求される。

Research Products

• [Publications] K.Inoue, K.Nagai, T.Takita: "Coagulation of soy protein isolates induced by subtilisin Carlsberg"J. Agric. Food Chem.. 50・5. 1237-1242 (2002)
• [Publications] T.Sakai, R.Shinkyo, K.Inouye 他2名: "Biodegradation of polychlorinceted dibenzo-p-dioxins(PCDDS)by recombinant"Archi. Biochem. Biophys.. (印刷中). (2002)
• [Publications] K.Inouye, I.Ueno, S.Yokoyama, T.Sakaki: "Development of a synchronous enzyme-reaction system for a higlysensitive enzyme"J. Biochem.. 131・1. 97-105 (2002)
• [Publications] K.Inouye, M.Shiihara, T.Uno 他1名: "Deodorization of soybean proteins by enzymatic and physicochemical treatments"J. Agric. Food Chem.. (印刷中). (2002)
• [Publications] N.Sawada, T.Sakaki, K.Inouye 他2名: "Structure-function analysis of CYP27B1 and CYP27AI : studies on mutants"EUR. J. Biochem.. 268. 6607-6615 (2001)
• [Publications] K.Inouye, S.Kondo, T.Sakaki 他2名: "Inhibitory effects of detergents on rat CYPIAI-dependent monooxygenase"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 280・5. 1346-1351 (2001)
• [Publications] H.Oneda, K.Inouye: "Interactions of human matrix metallo-proteinase7 (matrilysin) with the"J. Biochem.. 129・3. 429-435 (2001)
• [Publications] K.Kuzuya, K.Inouye: "Effects of cobalt-substitution of the active Zinc ion in themolysin"J. Biochem.. 130・6. 783-788 (2001)
• [Publications] K.Inouye, S.Ohnaka: "Pepsin digestion of a mouse monoclonal antibody of IgGl class formed"J. Biochem. Biophys. Methods. 48・1. 23-32 (2001)
• [Publications] K.Inouye, T.Sakaki: "Enzymatic Studies on the key enzymes of vitamin D metabolism : 1α"Biotechnol. Annu. Rev.. 7. 179-194 (2001)
• [Publications] S.Okumura, T.Akao, K.Inouye 他2名: "Screening of the Bacillus thuringiensis CrylAc d-endotoxin on"J. Biochem. Biophys. Methods. 47・3. 7-88 (2001)
• [Publications] 滝田禎亮, 井上國世: "アミノアシル-tRNA合成酵素の進化"化学と生物. 39・9. 566-567 (2001)
• [Publications] 榊利之, 井上國世: "ビタミンD_3の代謝を司る3つの酵素、大腸菌発現系を用いたミトコンドリア型"化学と生物. 39・11. 635-637 (2001)
• [Publications] 井上國世: "酵素ハンドブック(第3版)"朝倉書店(印刷中). (2002)
• [Publications] K.Inouye: "Handbook of Food Enzymology"Mercel Dekker(印刷中). (2002)