内分泌攪乱物質が魚類の生殖に及ぼす影響の機構解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13027202
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 原 彰彦 北海道大学, 大学院・水産科学研究科, 教授 (40091483)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松原 孝博 北海道区水産研究所, 海区水産業研究部, 室長 ; 征矢野 清 長崎大学, 水産学部, 助教授 (80260735) ; 足立 伸次 北海道大学, 大学院・水産科学研究科, 助教授 (40231930)
• Keywords: 内分泌攪乱物質 / 魚類 / ビテロジェニン / エストロジェン / 肝培養 / コリオジェニン / サケマス / 化学発光免疫測定法

Research Abstract

魚類を用いた環境エストロジェンの影響評価のバイオマーカーとしてビテロジェニン(Vg)に加えて卵膜蛋白前駆物質、コリオジェニン(Chg)が注目されている。今回、ChgとZona Pellucida Protein (ZP)の遺伝子レベルでの比較検討をするとともにサケ科魚類Chgの化学発光免疫測定法(CLIA法)を確立した。さらにエストロジェンによるin vitro及びin vivo系における動態をVgと併せて観察し、回遊中のサケ科魚類雄血中のChgの測定を行った。
Chg Hをコードする2種類のクローン(Chg Hα、Chg Hβ)およびChg Lをコードするクローンの全塩基配列を明らかにした。またRT-PCRにより、Chg遺伝子は肝臓でのみ発現していた。一方、卵巣からZPB及びZPCと思われる遺伝子を単離し、それらの発現は卵巣にのみ観察された。Chg H測定系は、0.12-125ng/ml、Chg Lは、0.24-250ng/mlでスタンダードカーブが得られ、高感度定量ができた。ニジマス雄の肝細胞培養系にE2を添加した結果、ChgはVg同様、2日目に培養液中に誘導された。Chg HはE2添加後2日目でVgと比べ、より低濃度のE2による誘導を確認した。
サケ科魚種ChgはWestern blotの結果、既報のサクラマスChg(Chg H:48k,Chg L:43k)と分子量が近似する一本のバンドが見られた。CLIAのサクラマス標準血清を用いたスタンダードカーブと各魚種血清の希釈系列は、ベニザケ血清のChg Lを除いて平行性を示した。北洋域のサケ科魚類雄血清中のVg並びにChgを測定した結果、各魚種でそれぞれ検出され、シロザケとスチールヘッドからは、これまで養殖魚で検討してきたベースライン(10μg/ml)を越える個体も観察された。

Research Products

• [Publications] H.Fukada: "Carp (Cyprinus carpio) vitellogenin : purification and development of a simultaneous chemiluminescent immunoassay."Comp.Biochem.Physiol.. 134A. 615-623 (2003)
• [Publications] N.Ohkubo: "Development of enzyme-linked immunosorbent assays (ELLS As) for two forms of vitellogenin in Japanese common goby (Acanthogobius flavimanus)."Gen.Comp.Endocrmol.. 131. 353-364 (2003)
• [Publications] S.Hashimoto: "Gonadal histology and serum vitellogenin levels of bigeye tuna Thunnus obesus from the Northern Pacific Ocean -absence of endocrine disruption bio-indicators."Mar.Pollut.Bull.. 46. 459-465 (2003)
• [Publications] N.Ohkubo: "Estrogenic activity in coastal areas around Japan evaluated by measuring male serum vitellogenins in Japanese common goby Acanthogobius flavimanus."Fish.Sci.. 69. 1133-1143 (2003)
• [Publications] N.Hiramatsu: "Identification, purification and classification of multiple forms of vitellogenin from white perch (Morone americana)."Fish Physiol.Biochem.. 26. 355-370 (2002, 2004)
• [Publications] T.Fujita: "Quantification of serum levels of precursors to vitelline envelope proteins (choriogenins) and vitellogenin in estrogen treated masu salmon, Oncorhynchus masou."Gen.Comp.Endocrinol.. 136. 49-57 (2004)
• [Publications] 征矢野 清: "月刊 海洋 -有明海の環境と生物生産-「有明海の環境ホルモン汚染」"海洋出版株式会社. 6 (2003)