RNAi酵素・RNA複合体及び関連蛋白質の構造解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13033007
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 善野 修平 東京大学, 大学院・理学系研究科, 助手 (90313204)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西郷 薫 東京大学, 大学院・理学系研究科, 教授 (50136454)
• Keywords: RNAi / Dicer / RNaseIII / PIWI / siRNA / 二本鎖RNA / 結晶

Research Abstract

平成14年度は、以下のことを検討した。ヒトとマウスのDicerとPIWI様蛋白に対応するcDNAを取得した。dicerはゲノム中に1コピーで、piwi様eIF2Cは4コピー存在した。ヒトDicerとEIF2C1全長について、GST融合とTRX融合での大腸菌発現系を検討したが、不溶性であった。一方、バキュロウイルス発現系ではヒト6xHis-Dicerは可溶化し、6xHis-EIF2C1は不溶化した。現在、結晶化用に全長Dicerを大量調製中である。また、古細菌Sulfolobus tokodaiiのPIWI蛋白の大腸菌発現系を検討したが、これも不溶化した。平成13年度に調製したDicerの6xHis-RbD(RNaseIIIドメイン(Rb)+二本鎖RNA結合ドメイン(D))は可溶性であったが、不活性体を含んでいた。不活性の原因は二本鎖RNA結合活性のDに由来していたので、次にRbのみの発現を検討した。Rb-6xHisはMonoQカラム上で均一でRNaseIII活性を有していた。結晶化スクリーニングの結果、リザーバー条件が25%エチレングリコールで結晶が得られ、R AXISで測定したところ、単位格子の角度がα、β、γ=90°、3軸の長さa=68,86Å、b=70,86Å、c=189,60Åの斜方晶で、空間群がP222であると分かった。現在、好熱菌Aquifex aelicus由来のRNaseIIIをサーチ分子として分子置換法で構造決定する作業を行なっている。また、RbDのRbでは活性中心のはずのGlu残基がPro残基に置換しているが、それを逆転させたP1730Eは野生型RbDと同程度の活性しか示さなかった。この結果は、現行のRNaseIII触媒活性モデルと合致せず、活性中心がGlu残基で説明できないことを意味している。

Research Products

• [Publications] Masahiro Sakurai: "Identification of possible substrate-specificity deternimants in NfsA, the major oxygen-insensitive nitroreductase from Escherichia coli"Flavins and Flavoproteins. (in press). (2003)
• [Publications] Woo Cheol Lee: "Crystallographic analysis of flavin oxidoreductase from Helicobacter pylori responsible for its susceptibility to antibiotic metronidazole"Flavins and Flavoproteins. (in press). (2003)
• [Publications] Noboru Doi: "Short-interfering-RNA-mediated gene silencing in mammalian cells requires Dicer and eIF2C translation initiation factors"Current Biology. 13・1. 41-46 (2003)
• [Publications] 程久美子: "哺乳類培養細胞でのsiRNAによるRNAiプロトコル"細胞工学. 21・9. 1058-1061 (2002)
• [Publications] 上田龍: "ショウジョウバエのRNAiプロトコル(誘導型RNAi)"細胞工学. 21・8. 931-940 (2002)
• [Publications] 程久美子: "RNAi法による逆遺伝学、新タンパク質科学実験法"大島泰郎・藤井義明・村松・喬 編、東京化学同人(印刷中). (2003)