カムオペロンの末端酸化酵素と電子供与体たんぱく質の複合体:複合体形成によって誘導される活性型構造の解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13033036
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 島田 秀夫 慶應義塾大学, 医学部, 助教授 (80095611)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堀 洋 大阪大学, 基礎工学研究科, 助手 (20127294) ; 江川 毅 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (10232935)
• Keywords: シトクロームP450 / カンファー / アミノ酸置換 / 水 / X線結晶構造解析 / プロトン供給 / ミオグロビン / 過酸化水素

Research Abstract

P450の触媒反応には、2等量の水素イオンが必須であるが、どのように水素イオンが酵素内部の活性部位に供給されるのかまだよく解明されていない。数多くのP450の中で最もよくその構造と機能の関連が明らかになっているカンファー水酸化反応を触媒するP450camにおいては、すでに内部の活性部位から分子表面近くに延びた水素結合のネットワークの存在と、それを介しての水素イオンの供給を我々は提唱している。今回はそのネットワークに酵素外部から水素イオンが供給される仕組みを研究した。そこで分子表面にあり上述したネットワークに水素イオンを供給できる位置にあるアスパラギン酸を、水素イオンとの解離会合ができないアスパラギン、ロイシン、バリンに変異させた酵素を調製し、それらが一原子酸素添加反応、酵素の構造、そして水素イオン供給反応の及ぼす効果をX線結晶構造解析などの方法を用いて検討した。その結果、野生型の場合、上述した分子表面のアスパラギン酸を介して水素イオンが内部のネットワークに供給されることが示唆された。一方ロイシン変異酵素の場合、ロイシン側鎖の揺らぎが大きく、そのため水分子が直接内部のネットワークに水素イオンを供給する可能性が分子表面解析などから示唆された。したがってP450の場合、表面のアミノ酸残基を介したP450camで認められる水素イオン取り込み機構と直接水分子が運ぶ少なくとも二つの機構が存在する可能性が示唆された。
また酸素と可逆的に結合するミオグロビンは、過酸化水素と反応させると0-0結合の切断反応を起こし、活性酸素原子を生じて有機化合物のperoxygenase反応を触媒する。したがってP450による一原子酸素添加反応の格好のモデルとなる。今回このミオグロビンを用いてペルオキシ型反応中間体を捕らえることに成功し、0-0結合の切断反応に及ぼすアミノ酸残基の役割を実証することに成功した。

Research Products

• [Publications] 市川 祐介: "P450camの分子表面残基Asp182 : Val-, Asn-, Leu- 変異酵素の性質と結晶構造"生化学. 73. 874 (2001)
• [Publications] 下方 國稔: "ウシ/ヒトハイブリッドチトクロム酸化酵素の発現系の構築"生物物理. 41. S115 (2001)
• [Publications] Tomita, T.: "Elucidation of the differences between the 430- and 455-nm absorbing forms of P450-isocyanide adducts by resonance Raman spectroscopy"J.Biol.Chem.. 276. 36261 (2001)