2001 Fiscal Year Annual Research Report
環境汚染物質やシグナル伝達物質を分解する酸素添加酵素の設計原理解明と指向進化
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13125202
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (B)
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| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
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Principal Investigator |
堀池 喜八郎 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (80089870)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木村 隆英 滋賀医科大学, 医学部, 助教授 (70167378)
田中 裕之 滋賀医科大学, 医学部, 助手 (10293820)
石田 哲夫 滋賀医科大学, 医学部, 助教授 (10176191)
喜田 昭子 京都大学, 大学院・理学研究科, 助手 (70273430)
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| Keywords | 酵素添加酵素 / カテコール2,3-ジオキゲナーゼ / ニトロフェノール / カテコール / 酸素分子 / 結晶構造 / 非ヘム鉄 / 電荷移動錯体 |
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| Research Abstract |
本年度は、カテコール2,3-ジオキシゲナーゼについて、基質認識と酸素活性化の機構を中心に研究し,以下の成果を得た。
1、フェノール誘導体で分子内の適当な位置にOH基とは別の酸素原子をもつ化合物は活性部位でフェノレートアニオンとなり、二価鉄イオンに二座配位する。この複合体は、電荷移動錯体に特徴的な吸収を長波長領域に示すが、カテコール誘導体とは異なり、酸素を活性化しない。パラ置換体は、逆に、活性部位でプロトン付加される。活性部位には、鉄のリガンドとは別に、2個のヒスチジン残基と1個のチロシン残基が存在するが、これらの結果は、フェノール誘導体との相互作用を通してこれらの残基の役割を定量的に解明できることを示した。複合体の結晶構造解析も重要だが,現在進行中である。
2、低濃度条件下で本酵素の活性を安定に保持する方法をアスコルビン酸/アスコルビン酸酸化酵素系を利用して確立し,精確な反応動力学的解析が初めて可能となった。この一連研究のなかで、溶存酸素より過剰量の4-クロロカテコールを酸素定量試薬として用いることで,nMレベルまでの酸素濃度を絶対測定できる方法を見出し,ほぼ確立した。現在、連続測定や酸素濃度制御への展開を進めている。
3、嫌気下で、基質やフェノール誘導体と本酵素との相互作用を定量的に調べるため,フロンタルゲルろ過法をさらに改良した。この過程で,3ドメインタンパク質であり、特異的金属結合部位を持つヒト血清アルブミンの生理的構造転移を解明するのにFMNが役立つことを発見した。
4、二価鉄イオンの役割と金属置換による新活性獲得の可能性を探るため、ポリフェノール類と二価銅イオンとの相互作用を調べ,酸素分子をヒドロキシラジカルに活性化する配位子構造と酸素を活性化しない配位子構造とが存在することが分かった。モデルペプチド配位子を設計し検討中である。
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Research Products
(5 results)
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[Publications] Hirofumi Nakajima: "Accurate measurement of near-micromolar oxygen concentrations in aqueous solutions based on enzymatic extradiol cleavage of 4-chlorocatechol : applications for improved low-oxygen experimental systems and quantitative assessment of the back diffusion of oxygen from the atmosphere"J. Biochem.. (印刷中). (2002)
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[Publications] Tetsuo Ishida: "Structure and reaction mechanism of catechol2,3-dioxygenase"Excerpta Medica ICS. 863(印刷中). (2002)
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[Publications] Osamu Sawada: "Frontal gel chromatographic analysis of the interaction of a protein with self-associating ligands : aberrant saturation in the binding of flavins to bovine serum albumin"J. Biochem.. 129. 899-907 (2001)
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[Publications] Kihachiro Horiike: "Distribution of D-amino-acid oxidase and D-serine in vertebrate brains"J. Mol. Catal.. 12B. 37-41 (2001)
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[Publications] Hisashi Yoshioka: "Spin-trapping study on the hydroxyl radical formed from a tea catechin-Cu(II) system"Biosci. Biotech. Biochem.. 65. 1697-1706 (2001)
