環境汚染物質やシグナル伝達物質を分解する酸素添加酵素の設計原理解明と指向進化

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13125202
• Research Institution: SHIGA UNIVERSITY OF MEDICAL SCIENCE
• Principal Investigator: 堀池 喜八郎 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (80089870)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木村 隆英 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (70167378) ; 田中 裕之 滋賀医科大学, 医学部, 助手 (10293820) ; 石田 哲夫 滋賀医科大学, 医学部, 助教授 (10176191) ; 喜田 昭子 京都大学, 大学院・理学研究科, 助手 (70273430)
• Keywords: 酸素添加酵素 / 酵素反応機構 / 非ヘム鉄 / 結晶構造 / カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ / 2,3-ジヒドロキシビフェニール / ホモプロトカテク酸 / 置換基効果

Research Abstract

本年度は、extradiol型酸素添加酵素のカテコール認識機構と酸素分子の結合・活性化機構を解明した。
1.好熱菌Thermus thermophilus HB8由来ホモプロトカテク酸2,3-ジオキシゲナーゼ(HPCD)の構造と機能を解析し、基質のC4-カルボキシメチル基がHis233、Arg228、Gln278により特異的に認識されること、親水性のAsn141の存在が低い酸素分子結合速度と過酸化水素への異常な耐性に関与することが分かった。
2.カテコール2,3-ジオキシゲナーゼ(Mpc)と2,3-ジヒドロキシビフェニール1,2-ジオキシゲナーゼ(BphC)の構造・反応動力学定数・基質結合定数の比較から、BphCのカテコール環結合部位が狭くC3-置換基とIle174・His209・Phe201との相互作用がEA複合体形成を助け、MpcではカテコールのC3置換基は基質結合速度に影響せず、酵素-基質複合体(EA複合体)の安定性を減少させることが分かった。
3.Mpcの基質結合速度とEA複合体結合エネルギーへのC3/C4置換基効果の解析から、置換基の電子吸引性が強いほど基質結合速度は遅くなり、EA複合体の安定性は置換基の立体的な要素に影響されることが分かった。拮抗阻害剤フェノールの結合が置換基の電子吸引性が強いほど強くなることから、酵素へのカテコールの結合は1座位中間体を経る多段階反応であることが強く示唆された。
4.Mpc,BphC,HPCDの基質飽和条件下での反応速度の酸素濃度依存性から、置換基の電子吸引性が強いほどEA複合体への酸素分子の結合・活性化速度が遅くなることが分かり、カテコールから酸素分子への1電子移動が醗素活性化に重要であることが証明された。Mpcの酸素結合部位は、カテコール環とHis199,A202,Leu155,Phe191で構成され、BphCではロイシンがバリンに代わり疎水性ポケットが広くなり、HPCDではロイシンがアスパラギンに代わり疎水性が部分的に壊されている。これらの構造から各酵素の機能的性質が説明できた。
5.C4置換カテコールはBphCの基質にならず、酸素依存性にBphCを失活させた。構造解析からC4置換カテコールが基質とは異なる仕方で鉄イオンに2座配位するごとが分かり、活性化された酸素分子がスーパーキシドアニオンとして遊離し、活注中心鉄イオンが2価から3価に酸化されることが示唆された。
6.EAO_2複合体からαケトラクトン中間体の変換では立体的な反応制御が重要であることが分かった。