キノン型ビルトイン補酵素及び金属イオンを含有するコンポジット触媒の分子設計

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13125204
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 谷澤 克行 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (20133134)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山口 宏 関西学院大学, 理学部, 専任講師 (10252719) ; 岡島 俊英 大阪大学, 産業科学研究所, 助教授 (10247968) ; 笹井 宏明 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (90205831)
• Keywords: 触媒・化学プロセス / 生物・生体工学 / ナノバイオ / 分子認識 / ビルトイン補酵素 / 複合酵素 / キノン補酵素

Research Abstract

生体内で多彩な化学反応を行っている酵素の多くは、さまざまな金属イオンや有機低分子化合物(補酵素)を含んでいて、それらの存在なしには触媒機能を発揮できない。換言すれば、タンパク質を構成している20種類のアミノ酸残基のみでは触媒できる反応の種類が限られているが、こうした金属イオンや補酵素を結合することで、タンパク質は多様な反応を触媒する能力を獲得する。本研究では、高効率な酸化還元反応の触媒能力を有するキノン型ビルトイン補酵素や金属イオン、さらには有機金属不斉触媒をタンパク質に導入したコンポジット触媒を新たに分子設計することを目的としている。平成14年度は、銅アミン酸化酵素に含まれるビルトイン型補酵素の一種、トパキノン(TPQ)が銅イオン依存的に自動的に生成する過程を時間分割X線結晶解析により追跡し、トパキノン生成過程における活性部位の構造変化を明らかにした。一方、銅アミン酸化酵素は、微生物から哺乳動物に至る生物界に広く分布し、種々の生理活性アミン類の酸化的脱アミノ反応を触媒する酵素である。本酵素の触媒過程は、酸化型TPQが基質により還元され還元型TPQと第一生成物のアルデヒドが生成する'還元的半反応'と、還元型TPQが分子状酸素により再酸化されアンモニアと過酸化水素が生じる'酸化的半反応'の2つに大きく分けられる。銅イオンはTPQ補酵素生成だけでなく、触媒反応(特に酸化的半反応)においても必須の役割を果たす。本酵素の活性部位には、これら銅イオン、TPQ補酵素以外に、さまざまな生物種由来の酵素で高度に保存されているいくつかのアミノ酸残基が存在する。このうち、還元的半反応において基質がTPQに結合した中間体からプロトンを引き抜く塩基として機能すると考えられているアスパラギン酸残基は最も重要である。そこで、土壌細菌Arthrobacter globiformis由来の銅アミン酸化酵素(AGAO)の触媒塩基であるアスパラギン酸残基(Asp298)に変異を導入し、変異型酵素の反応速度論的解析とX線結晶解析を行うことにより、本酵素の精密な触媒反応機構を解明した。

Research Products

• [Publications] S.Kishishita, T.Okajima, M.Kim, H.Yamaguchi, S.Hirota, S.Suzuki, S.Kuroda, K.Tanizawa, M.Mure: "Role of Copper Ion in Bacterial Copper Amine Oxidase : Spectroscopic and Crystallographic Studies of Metal-substituted Enzymes"J. Am. Chem. Soc.. 125. 1041-1055 (2003)
• [Publications] T.Kanno, T.Yamada, H.Iwabuki, H.Tanaka, S.Kuroda, K.Tanizawa, T.Kawai: "Size Distribution Measurement of Vesicles by Atomic Force Microscopy"Anal. Biochem.. 309. 196-199 (2002)
• [Publications] X.Zhang, S.Kuroda, D.Carpenter, I.Nishimura, C.Soo, R.Moats, K.Iida, E.Wisner, F.-Y.Hu, S.Miao, S.Beanes, C.Dang, H.Vastardis, M.Longaker, K.Tanizawa, N.Kanayama, N.Saito, K.Ting: "Craniosynostosis in Transgenic Mice Overexpressing Nell-I"J. Clin. Invest.. 110. 861-870 (2002)
• [Publications] T.Okajima, D.Kitaguchi, K.Fujii, H.Matsuoka, S.Goto, S.Uchiyama, Y.Kobayashi, K.Tanizawa: "Novel Trimeric Adenylate Kinase from an Extremely Thermoacidophilic Archaeon, Sulfolobus solfataricus : Molecular Cloning, Nucleotide Sequencing, Expression in Escherichia coli, and Characterization of the Recombinant Enzyme"Biosci. Biotech. Biochem.. 66. 2112-2124 (2002)
• [Publications] K.Kim, T.Okajima, S.Kishishita, M.Yoshimura, A.Kawamori, K.Tanizawa, H.Yamaguchi: "X-ray Snapshots of Quinone Cofactor Biogenesis in Bacterial Copper Amine Oxidase"Nature Struct. Biol.. 9. 591-596 (2002)
• [Publications] S.Iwaki, M.Ogasawara, R.Kurita, O.Niwa, K.Tanizawa, Y.Ohashi, K.Maeyama: "Real-time Monitoring of Histamine Released from Rat Basophilic Leukemia (RBL-2H3) Cells with a Histamine Microsensor Using Recombinant Histamine Oxidase"Anal. Biochem.. 304. 236-243 (2002)
• [Publications] R.Kurita, K.Hayashi, T.Horiuchi, O.Niwa, K.Maeyama, K.Tanizawa: "Differential Measurement with a Microfluidic Device for the Highly Selective Continuous Measurement of Histamine Released from Rat Basophilic Leukemia Cells (RBL-2H3)"Lab Chip. 2. 34-38 (2002)
• [Publications] A.Satoh, J.K.Kim, I.Miyahara, B.Devreese, I.Vandenberghe, A.Hacisalihoglu, T.Okajima, S.Kuroda, O.Adachi, J.A.Duine, J.Van Beeumen, K.Tanizawa, K.Hirotsu: "Crystal Structure of Quinohemoprotein Amine Dehydrogenase from Pseudomonas putida. Identification of a Novel Quinone Cofactor Encaged by Multiple Thio-Ether Cross-Bridges"J. Biol. Chem.. 277. 2830-2834 (2002)