新規H^+ポンプピロホスファターゼの構造と作動機構

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13142203
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 前島 正義 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 教授 (80181577)
• Keywords: H^+-ピロホスファターゼ / 液胞膜 / 結晶形成 / NMR解析 / リコンビナントタンパク質

Research Abstract

液胞型H^+ポンプピロホスファターゼ(H^+-PPase)は、植物と光合成細菌に加えて、ある種の原生動物、古細菌等にも存在する。H^+-PPaseは、タンパク質等の高分子合成の副産物として生成するピロリン酸を基質とし、その加水分解に連動してH^+を能動輸送する。しかもF型、V型H^+ポンプと異なり、1本のポリペプチドが基質加水分解とH^+輸送の2つの共役した機能を担う。そこで、本酵素の高次構造と作動機構を解明することを目的に、結晶形成とそれに引き続く電子線およびX線解析を研究目標としている。植物組織(ヤエナリ胚軸)から液胞膜を大量に調製し、ここからH^+-PPaseを大量精製し、透析ボタンを用いる結晶化条件の検討を進めた。多数の条件検討の結果、N末端の一部の配列を除去することにより、再現性よく結晶が得られることを明らかにした。現在の結晶は長さ10〜20μmの大きさであり、X線解析用に、さらに大きな結晶にする方法を検討中である。その一環として、活性型酵素を認識するモノクロナル抗体を調製中である。さらに酵素の触媒部位(約100アミノ酸残基)のNMR解析を目的として、リコンビナントタンパク質の大量合成と精製の方法を確立し、約3mgの精製標品を得た。今後、具体的な解析を進める。また、H^+-PPaseの新規阻害剤を軟サンゴの水溶性抽出液の中から見出し、これが、他のH^+ポンプを阻害しないこと、生細胞で液胞酸性化を抑制することなどを実証した。なお、この阻害剤に関する成果、ならびにH^+-PPase機能のパッチクランプ法によるリアルタイム測定について論文を投稿中である。

Research Products

• [Publications] Ikeda, M.: "Functional expression of Acetabularia acetabulum vacuolar H^+-pyrophosphatase in a yeast VMA3-deficient strain"J.Experimental Botany. 53. 2273-2275 (2002)
• [Publications] Yuasa, K.: "Equilibrium dialysis measurements of the Ca^<2+>-binding properties of recombinant radish vacuolar Ca^<2+>-binding protein expressed in E.coli"Biosc.Biotechnol.Biochem.. 66. 2382-2387 (2002)
• [Publications] Suga, S.: "Aquaporin isoforms responsive to salt and water stresses and phytohormones in radish seedlings"Plant Cell Physiol.. 43. 1229-1237 (2002)
• [Publications] Pittman, J.K.: "Distinct N-terminal regulatory domains of Ca^<2+/>H^+ antiporters"Plant Physiology. 130. 1054-1062 (2002)
• [Publications] Fujiwara, S.: "Molecular properties of a unique matrix attachment region-binding protein in tobacco cells"Plant Cell Physiol.. 43. 1558-1567 (2002)
• [Publications] Yang, S.: "Modulation of vacuolar H^+-pumps and aquaporin by phytohormones in rice seedling leaf sheaths"Biol.Pharm.Bull.. 26. 88-92 (2002)
• [Publications] Mimura, T.: "Rapid increase of vacuolar volume in response to salt stress"Planta. 216. 397-402 (2003)
• [Publications] Hagiwara, Y.: "Subcellular localization of host and viral proteins associated with tobamovirus RNA replication"EMBO J.. (In press). (2003)
• [Publications] Suga, S.: "An abundance of aquaporins in specific cells and osmotic water permeability of individual protoplasts of radish"Plant Cell Physiol.. 44(In press). (2003)
• [Publications] 中西 洋一: "液胞のCa^<2+>集積とプロトンポンプ"蛋白質核酸酵素. 47. 1777-1782 (2002)
• [Publications] 須賀 しのぶ: "液胞膜の分化と多様性"細胞工学別冊 植物細胞工学. 17. 190-195 (2002)
• [Publications] 前島 正義: "液胞膜H^+-ピロホスファターゼと膜ダイナミクス"細胞工学. 12. 1522-1527 (2002)
• [Publications] 中西 洋一: "液胞型H^+ポンプ"細胞工学別冊 植物細胞工学. 18(印刷中). (2003)
• [Publications] 三村 久敏: "膜輸送システムの分子構造と機能"細胞工学別冊 植物細胞工学. 18(印刷中). (2003)
• [Publications] 前島 正義: "膜輸送系の阻害剤"細胞工学別冊 植物細胞工学. 18(印刷中). (2003)
• [Publications] Maeshima, M.: "Handbook of Plant Growth. pH as a Master Variable in Plant Growth"Marcel Dekker, Inc.. 446 (2002)