動物細胞Na^+/H^+アンチポータの構造・機能・調節

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13142210
• Research Institution: National Cardiovascular Center Research Institute
• Principal Investigator: 若林 繁夫 国立循環器病センター研究所, 循環分子生理部, 部長 (70158583)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岩田 裕子 国立循環器病センター研究所, 循環分子生理部, 室員 (80171908)
• Keywords: Na^+ / H^+アンチポータ / 細胞内pH / 結晶構造 / 生物・生体工学 / 生物物理 / ナノマシン / 生体分子 / タンパク質

Research Abstract

Na^+/H^+交換輸送体(NHE)には組織特異的に発現する様々なアイソフォームがあるが、私達はこれまで、これらのNHEが生理的な活性を発揮するためには、普遍的に発現するCa^<2+>結合タンパク質の一種、CHP(CHP1と呼ぶ)との相互作用が必須であることを明らかにした。また、別のCHPアイソフォームCHP2は細胞の癌化にともなって発現し、CHP2が発現するとNHE1は活性化状態になり、高い細胞内pHの維持、無血清に対する高い抵抗性など、癌細胞特有のフェノタイプを示すようになることがわかった。また、CHP1のEFハンドCa^<2+>結合モチーフの役割を解析した。CHP1のEF3およびEF4に二つのモチーフにCa^<2+>高親和性(Kd=90μM)に結合すること、NHE1との相互作用によってCa^<2+>親和性が約40倍増加することを見出した。また、種々の発現実験から、CHP1はCa^<2+>センサーとしては機能せず、EFハンドに強固に結合したCa^<2+>が重要な構造的エレメントとしてNHE1のpH調節に寄与することが示唆された。
NHE1によるpH調節には、H^+輸送部位とは別のH^+結合部位(H^+制御部位あるいはpHセンサー)が存在し、そのH^+親和性の変化が重要であることが示唆されている。今回そのような付加的なH^+結合部位の存在を証明するため、Na^+/H^+交換の逆反応(^<22>Na^+流出)を測定し、H^+輸送部位とH^+制御部位を速度論的に区別することに成功した。また、部位特異的変異導入の手法を用いてNHE1の第5細胞内ルーブのArg440残基およびGly455/Gly456残基がNHE1のpHセンサーの制御に重要であることを見出した。

Research Products

• [Publications] Pang, T. et al.: "Role of Calcineurin B Homologous Protein in pH Regulation by the Na^+/H^+ Exchanger 1 : Tightly Bound Ca^<2+> Ions as Important Structural Elements."Biochemistry. in press. (2004)
• [Publications] Wakabayashi, S., et al.: "Kinetic dissection of two distinct proton binding sites in Na^+/H^+ exchangers by measurement of reverse mode reaction."J.Biol.Chem.. 278(44). 43580-43585 (2003)
• [Publications] Iwata, Y., et al.: "A novel mechanism of myocyte degeneration involving the Ca^<2+>-permeable growth factor-regulated channel."J.Cell.Biol.. 161(5). 957-967 (2003)
• [Publications] Su, X., et al.: "Evidence for involvement of the putative first extracellular loop in differential volume-sensitivity of the Na^+/H^+ exchangers NHE1 and NHE2."Biochemistry. 42. 1086-1094 (2003)
• [Publications] Wakabayashi, S., et al.: "Mutations of Arg440 and Gly455/Gly456 Oppositely Change pH-Sensing of Na^+/H^+ Exchanger NHE1."J.Biol.Chem.. 278. 11828-11835 (2003)
• [Publications] Hirata, T., et al.: "Wakabayashi, S., Shigekawa, M., Chang, M.-H., Romero M., Hirose, S. : Mechanism of acid adaptation of a fish living in a pH3.5 lake."Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol.. 284(5). R1199-R1212 (2003)
• [Publications] Wakabayashi, S., et al.: "Two Fundamental Regulatory Factors of the Na^+/H^+ Exchangers : The Proton and CHP. "The Sodium-Hydrogen Exchange. From Molecule to its Role in Disease"."Kluwer Academic Publishers. 15 (2003)