サブトラクション抗体作成法を用いたゼノパス発生関連蛋白質の網羅的解析

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13202038
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 佐藤 賢一 神戸大学, 遺伝子実験センター, 助手 (30235337)
• Keywords: 機能ゲノミクス / プロテオミクス / 免疫サブトラクション / 受精 / アフリカツメガエル / ディフェレンシャルディスプレイ / モノクローナル抗体 / ラフト

Research Abstract

当初計画
年度前半は、昨年度後半より開始したモノクローナル抗体作成を引き続き行う。4月、未精製ハィブリドーマの培養上清を用いたスクリーニング。5〜6月、ハィブリドーマのクローニング。7月、腹水採取およびモノクローナル抗体の精製。8〜9月、抗体反応性ゼノパス卵蛋白質の同定と免疫組織化学的解析。年度後半は、抗体により同定された蛋白質の質量分析と遺伝子クローニングを行う。また平行して、受精関連の膜ラフト蛋白質の分子同定と特異抗体作成実験を行う。4〜6月、精製膜ラフト蛋白質の調製。7〜8月、質量分析実験及び合成ペプチド作成。9〜11月、遺伝子クローニング、培養細胞発現実験、ウサギの免疫。12〜2月、発現膜ラフト蛋白質の活性再構成実験と抗体の精製。
研究成果
ゼノパス受精卵特異的な反応性を示すモノクローナル抗体群を作成した。クローンの1つは、受精後の卵蛋白質と強い反応性を持つことが確認された。この抗原蛋白質は受精卵における局在性が免疫組織化学的手法により明かとなった。抗体の標的には、新規合成蛋白質のアミノ酸配列、翻訳後修飾基(リン酸基、糖鎖、ユビキチン基など)、非蛋白質性の抗原(脂質成分等)等が考えられ、現在検証中である。さらにまた、抗体クローンが別種の動物受精卵に特異的反応性を持つか、という点についてもマウスなどのモデル動物を使って検証している。この実験により、動物種を超えた共通の受精特異的抗原の存在を検討することになる。以上の結果の一部は班会議で報告したが、特許申請のため一般の公表は控えている。一方、未受精卵の膜ラフトの受精成立関連因子である蛋白質チロシンキナーゼの精製、質量分析、分子同定、細胞発現実験、及び特異抗体作成が予定通り進み、日本分子生物学会(12月、横浜)で発表した。その関連で、国際会議での口頭発表(国際プロテオミクス会議、10月、キャンベラ)や論文発表(成果公表リスト参照)を行った。

Research Products

• [Publications] Sato, Ken-ichi: "Low density detergent-insoluble membrane of Xenopus eggs : Subcellular microdomain for tyrosine kinase signaling in feftilization"Development. 129(印刷中). (2002)
• [Publications] Tokmakov, Alexander A.: "Calcium oscillations in Xenopus egg cycling extracts"Journal of Cellular Biochemistry. 82. 89-97 (2001)
• [Publications] Sato, Ken-ichi: "Hydrogen peroxide induces Src family tyrosine kinase-dependent activation of Xenopus eggs"Devlopment Growth and Differentiation. 43. 55-72 (2001)
• [Publications] 佐藤 賢一: "新しい蛋白質研究、プロテオミクスがもたらすもの"BIONDUSTRY. 18. 52-58 (2001)
• [Publications] Fukami, Yasuo: "Inhibition and activation of c-Src : The head and tail of a coin"Pharmacology and Therapeutics. (印刷中). (2002)