2001 Fiscal Year Annual Research Report

p27^<kip1>のコンデショナルノックアウトによるヒト腫瘍の悪性化の解析

Research Project

Project/Area Number	13214043
Research Institution	Hamamatsu University School of Medicine
Principal Investigator	北川雅敏浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	内田千晴浜松医科大学, 医学部, 助手 (60223567) 北川恭子浜松医科大学, 医学部, 助手 (20299605)
Keywords	p27^<Kip1> / ジーンターゲッティング / 癌 / 予後 / 細胞周期
Research Abstract	[研究目的]近年ヒトの大腸癌、胃癌、乳癌や肺癌の予後の悪さとp27の分解活性が正の相関を示すことが報告された。しかしp27のノックアウトマウスは巨大化、下垂体に良性腫蕩を形成するが、癌を形成することはなく、p27の枯渇による癌形質のさらなる悪性化や予後不良となる実験的証明やそのメカニズムについては全くわかっていない。またノックアウトマウスではヒト遺伝子の細胞レベルでの機能を調べることは障害も多い。そこで本研究ではヒト培養細胞株の特定遺伝子をコンディショナルにノックアウトする方法を用いて、ヒト腫瘍細胞のp27をコンデショナルノックアウトする。ノックアウト細胞の癌形質の解析を行うことにより、p27の枯渇と癌形質のさらなる悪性化の実験的証明を行う。さらに、さらに発現が変動する遺伝子を検索し、予後不良の癌形質に関与する遺伝子を同定することにより、予後不良の癌形質形成メカニズムの解明を目指す。 [方法と結果]培養細胞でp27の両対立遺伝子をノックアウトするためにはneomycinおよびhygromycin耐性遺伝子を選択マーカーとした2種類のターゲッテイングベクターを作成する。相同組み換え体を効率よく選択するためにジフテリア毒素遺伝子(DT-A)を標的遺伝子のロングアーム上流に配置する。コンデショナルなノックアウトにはCre-loxPシステムを用いる。つまりエキソンとTk遺伝子をloxP配列で挟み、Cre-アデノウイルスを感染することでノックアウトできるようにする。本年度はこのneomycinおよびhygromycinターゲツテイングベクター(Version 1)の作製が完了した。現在p27の分解が冗進していない大腸癌細胞HT116にタゲティングベクターを導入し、相同組み換え体をPCRでスクリーニングしている。一方、ES細胞やDT細胞と異なり通常のヒト培養細胞は相同組み換えの効率が低い。そこで相同組み換えの選択効率をあげるため、polyAシグナルを欠いたターゲッテイングベクター(Version 2)を作製した。この場合、相同組み換えにより内因性p27遺伝子のpolyAシグナルを得た場合のみ耐性マーカーが発現することになり、選択効率の上昇が期待できる。こちらも現在スクリーニング中である。ノックアウト細胞取得後は、in vitroおよびin vivo系での転移浸潤能、血管遊走能などの癌形質を解析する。さらにマイクロアレイ解析を行いp27の欠失で発現が変動する遺伝子を検索する。臨床の癌検体のマイクロアレイによる比較では検体間のバックグラウンドに違いがあるため予後不良の癌形質に関与する遺伝子を同定することは困難である。一方で、本研究ではバックグラウンドが同一なためにそれが可能になり、候補遺伝子を絞り込んだ後、将来的には臨床の癌検体を用いて検証する。

Research Products
(7 results)

All Other

All Publications (7 results)

[Publications] Nishida, T. et al.: "Characterization of a novel mammalian SUMO-1/Smt3-specific isopeptidase, a homologue of rat Axam, which is an Axin-binding protein promoting b-catenin degradation"Journal of Biological Chemistry. 276. 39060-39066 (2001)
[Publications] Katayama, K. et al.: "Overexpression of Cdk4/Cyclin D1 induces apoptosis in PC12 cells in the presence of trophic support"FEBS Letter. 509. 382-388 (2001)
[Publications] Sugiyama, T. et al.: "Involvement of CCAAT/enhancer-binding protein in regulation of the rat serine : pyruvate/alanine : glyoxylate aminotransferase gene expression"FEBS Letter. 508. 16-22 (2001)
[Publications] Takemura, M. et al.: "Stimulation of DNA polymerase a activity by cdk2-phosphorylated Rb Protein"Biochem. Biophys. Research. Communication. 282. 984-990 (2001)
[Publications] Kitagawa, K. et al.: "CYP2A6^*6,a novel polymorphism in Cytochrome P450 2A6, has a single amino acid substitution (R128Q) that inactivates enzymatic activity"Journal of Biological Chemistry. 276. 17830-17835 (2001)
[Publications] Yang, M. et al.: "Individual differences in urinary cotinine levels in Japanese smokers : relation to genetic polymorphism of drug-metabolizing enzymes"Cancer Epidemiol. Biomarkers prevention. 10. 589-593 (2001)
[Publications] 北川雅敏(分担執筆): "新女性医学大系41巻婦人科腫瘍の分子・細胞生物学"武谷勇二編中山書店. 452 (2001)

2001 Fiscal Year Annual Research Report

p27^<kip1>のコンデショナルノックアウトによるヒト腫瘍の悪性化の解析

Principal Investigator

北川 雅敏 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971)

Research Products

[Publications] Nishida, T. et al.: "Characterization of a novel mammalian SUMO-1/Smt3-specific isopeptidase, a homologue of rat Axam, which is an Axin-binding protein promoting b-catenin degradation"Journal of Biological Chemistry. 276. 39060-39066 (2001)

[Publications] Katayama, K. et al.: "Overexpression of Cdk4/Cyclin D1 induces apoptosis in PC12 cells in the presence of trophic support"FEBS Letter. 509. 382-388 (2001)

[Publications] Sugiyama, T. et al.: "Involvement of CCAAT/enhancer-binding protein in regulation of the rat serine : pyruvate/alanine : glyoxylate aminotransferase gene expression"FEBS Letter. 508. 16-22 (2001)

[Publications] Takemura, M. et al.: "Stimulation of DNA polymerase a activity by cdk2-phosphorylated Rb Protein"Biochem. Biophys. Research. Communication. 282. 984-990 (2001)

[Publications] Kitagawa, K. et al.: "CYP2A6^*6,a novel polymorphism in Cytochrome P450 2A6, has a single amino acid substitution (R128Q) that inactivates enzymatic activity"Journal of Biological Chemistry. 276. 17830-17835 (2001)

[Publications] Yang, M. et al.: "Individual differences in urinary cotinine levels in Japanese smokers : relation to genetic polymorphism of drug-metabolizing enzymes"Cancer Epidemiol. Biomarkers prevention. 10. 589-593 (2001)

[Publications] 北川雅敏(分担執筆): "新女性医学大系41巻 婦人科腫瘍の分子・細胞生物学"武谷勇二編 中山書店. 452 (2001)

北川雅敏浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971)

[Publications] 北川雅敏(分担執筆): "新女性医学大系41巻婦人科腫瘍の分子・細胞生物学"武谷勇二編中山書店. 452 (2001)