2002 Fiscal Year Annual Research Report
IL-6/受容体複合体の結晶構造解析とcDNA制御手法の開発
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13359003
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
月原 冨武 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (00032277)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
植木 龍夫 高輝度光科学研究センター, 放射光研究所利用施設部門, 部門長
吉崎 和幸 大阪大学, 健康体育部, 教授 (90144485)
川合 知二 大阪大学, 産業科学研究所, 教授 (20092546)
樋口 尚弘 インターサイト・ナノサイエンス株式会社, 代表取締役
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| Keywords | IL-6 / IL-6受容体 / 結晶構造 / 原子間力顕微鏡 / シグナル伝達 |
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| Research Abstract |
1.ヒトsoluble IL-6受容体精製実験
抗IL-6受容体抗体産生細胞(AUK181-6)をマウス30匹腹腔中で培養し,腹水からAUK181-6を分離・精製した.腹水30mlからAUK181-6 150mgを得た.sIL-6受容体を特異的に吸着させるアフィニティ支持体を作製した.このアフィニティ支持体のカラムを用いて,sIL-6受容体をsIL-6受容体産生CHO細胞の培養上清から分離した.培養上清250mlからsIL-6受容体約6mgを得た。
2.ヒトIL-6の新しい結晶系の結晶による構造解析
ソーキング法によるペプチドとの結合能を調べるために、溶媒含量の高い結晶を作成し、その構造決定を行った.これまでの結晶では見えなかったループ領域の構造が見えるようになった。現在ペプチドの溶解度を高めるために溶媒置換を行っている。
3.IL-6のIL-6受容体への結合を介した、シグナル伝達
IL-6のsite1(IL-6R結合部位)に結合するFELRYペプチド(15mer)を用いて機能阻害を検討した.IL-6依存性増殖細胞を用いてrIL-6刺激下に0.2〜25% FELRY飽和溶液を加えたところ、25%溶液でわずかに抑制がみられたが、確証は得られなかった。1)FELRYがsite1に結合するもののIL-6機能伝達部位を認識していない、2)FELRYは難溶で阻害量に達していない、3)site1がIL-6Rの結合部位ではない、等が考えられる。今後易溶性のペプチドを合成して、また阻害を示すscFvのヒトIL-6抗体(28kd)をPhage display法により得たのでこれも用いて検討する。
4.蛋白質分子の高分解能走査型プローブ顕微鏡像を得る手法の開発
IL6と同等の分子量を持つ蛋白質分子としてcytochrom c分子を、2次元結晶化させ固定する基板としてグラファイトを用い、原子間力顕微鏡(AFM)を用いて観察を行った。グラファイト基板に滴下時の蛋白質溶液(濃度50μg/ml)の温度が室温程度の場合、蛋白質分子は基板上にランダムに凝集することがAFM観察により明らかになった。一方、試料溶液を80℃程度に昇温させて行った場合では、下地基板(グラファイト)の結晶方位に沿った2次元結晶構造を得ることに成功した。
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[Publications] Choy EH, et al.: "Therapeutic benefit of blocking interleukin-6 activity with an anti-interleukin 6 receptor monoclonal antibody in rheumatoid arthritis : a randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation trial"Arthritis Rheum.. 46. 3143-3150 (2002)
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[Publications] Nishimoto N, et al.: "Toxicity, pharmacokinetics, and dose finding study of repetitive treatment with humanized anti-interleukin 6 receptor antibody, MRA, in rheumatoid arthritis -a phase I/II clinical study of MRA for rheumatoid arthritis in Japan"J.Rheum.. (in press). (2003)
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[Publications] Gejima R, et al.: "Human single-chain Fv (scFv) antibody specific to human IL-6 with the inhibitory activity on IL-6-signaling"Human Antibody. (in press). (2003)
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[Publications] Nakahara H, et al.: "Anti-interleukin-6 receptor antibody therapy reduces vascular endotherlial growth factor (VEGF) production in rheumatoid arthritis"Arthritis Rheum.. (in press). (2003)
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[Publications] Mizushima T., Tsukihara T.: "The proteasome as a drug target"Methods and Principles in Medicinal Chemistry. (in press). (2003)
