孔辺細胞青色光情報伝達系における蛋白質のリン酸化・脱リン酸化反応の研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13440243
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 島崎 研一郎 九州大学, 大学院・理学研究院, 教授 (00124347)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木下 俊則 九州大学, 大学院・理学研究院, 助手 (50271101) ; 土井 道生 九州大学, 大学教育センター, 助手 (00167537)
• Keywords: 気孔 / プロトンポンプ / 孔辺細胞 / 14-3-3蛋白質 / リン酸化 / 脱リン酸化

Research Abstract

高等植物の気孔は青色光に反応して開口する。この気孔開口は青色光によるプロトンポンプがそのC-末をリン酸化されるためで有ることが明らかになっている。さらに、そのリン酸化部位にいわゆる14-3-3蛋白質が結合することがあきらかになっている。
しかし、このC-末の正確なリン酸化部位、14-3-3蛋白質の結合の意味、さらに、このC-末をリン酸化するプロテインキナーゼ、脱リン酸化するプロテインフォスファターゼの実体は不明である。本年度は、これらリン酸化、脱リン酸化に関わる問題の中で以下の点を明らかにした。
1)リン酸化部位の決定
C-末のスレオニンがリン酸化されることがすでに分かっているが、その正確な部位は不明である。しかし、その部位に14-3-3蛋白質が結合する事が推定される。そこで、あらかじめC-末領域のスレオニンをリン酸化したホスホペプチドを合成し、14-3-3の酵素C-末への結合と競合させた。その結果、C-末950番目のスレオニンがリン酸化されたホスホペプチドのみが14-3-3の結合を阻害した。この結果は、この950番目のスレオニンがリン酸化部位である事を示している。
2)14-3-3の結合の意味。
上記の研究から14-3-3の結合部位(リン酸化部位)が明らかになったが、それではこの結合の意味は何であろうか。われわれは、この事を直接解明する目的で、リン酸化部位に結合した14-3-3蛋白質を競合実験により解離させ、そのときのプロトンポンプのリン酸化状態とATP加水分解活性を測定した。その結果、リン酸化状態はほとんど維持されているにもかかわらず、14-3-3蛋白質が解離するとポンプ活性は強く阻害された。この結果は、ポンプが活性化されるには14-3-3タンパク質の結合が必須であることを示している。

Research Products

• [Publications] Toshinori Kinoshita: "Phot1 phot2 mediate blue light regulation of stomatal opening"Nature. 414. 656-660 (2001)
• [Publications] Toshinori Kinoshita: "Analysis of the phosphorylation level in guard-cell plasma membrane H+ -ATPase in response to Fusicoccin"Plant & Cell Physiology. 42. 424-432 (2001)
• [Publications] Takashi, Emi: "Specific binding of vf14-3-3a isoform to the plasma membrane H+-ATPase in response to blue light and fusicoccinin guard cells of broad beans"Plant Physiology. 125. 1115-1125 (2001)
• [Publications] Misumi Tominaga: "Gurd-cell chloroplasts provides ATP required for H+ pumping in the plasma membrane and stomatal opening"Plant & Cell Physiology. 42. 795-802 (2001)
• [Publications] 島崎研一郎: "植物の光センシング"秀潤社. 192 (2001)