アンチトロンビン凝固制御系遺伝子改変マウスを用いた血栓症発症メカニズムの解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13470203
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 高松 純樹 名古屋大学, 医学部・附属病院, 助教授 (80221365)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 晃士 名古屋大学, 医学部・附属病院, 医員 ; 松下 正 名古屋大学, 医学部・附属病院, 助手 (30314008) ; 小嶋 哲人 名古屋大学, 医学部, 教授 (40161913)
• Keywords: antithrombin / Svndecan / Polymerase chain reaction / platelet / thrombosis / Knock out mouse

Research Abstract

1)研究の目的
本研究ではヒト疾患において再現されていない凝固線溶遺伝子の機能を明らかにするため、遺伝子改変マウスを用いた解析を行う。Antithrombin欠失マウスを作製、さらにRyudocan欠失マウスとのとのダブル欠失マウスを作製することにより、(1)血栓症発症のタイミング・部位・重症度における差異、(2)向血栓刺激に対する反応性の相違、(3)血栓症病態発症条件の特定、(4)個体発生、炎症・臓器障害におけるHSPG-AT系の役割について明らかにする
2凝固・線溶因子の活動は微妙なバランスの上に成り立っており、血栓症リスクの高い個体においては他の因子の遺伝子発現調節に乱れが生じることが考えられる。1で生じた表現型が他の凝固・線溶因子遺伝子の発現調節にどの様な影響を与えているか、主要臓器における凝固・線溶遺伝子mRNAの量とその局在を通じて、生体が個体レベルで易血栓性をどの様に調節しようとするのか蛋白レベルでの解析も加えながら検討を行う。
2)平成13年度
今年度は相同組換え体の単離・同定とAntithrombin欠失マウスの作製およびその表現型解析を行った。既に、得られている129SVJマウスのゲノムライブラリーからのマウスAntithrombinゲノム遺伝子(全長)をもとにネオマイシン耐性遺伝子(MC1-neo)とジフテリア毒素Aフラグメント遺伝子(PGK-DTA)によるポジティブ・ネガティブセレクション用のターゲティングベクターを作成し、エレクトロポレーション(現有設備)によりES細胞(D3細胞)に導入、G-418含有ES培地により選択培養し、PCRおよびSouthern blottingを用いて解析して相同組換え体を単離した。これをンジェクションによりC57BL/6Jマウスより採取した胚盤胞に注入し、仮親の子宮に移植、仮親から生まれたキメラマウスをICRマウスと交配し、生まれたマウスをPCRおよびSouthern blottingにより変異アレルの伝搬を調べた。ヘテロ変異マウスと同定された雄雌を交配してホモ体を作製し、その表現型を解析したところAntithrombinホモ欠失マウスは死産もしくは胎内死亡に至ることがわかり、各妊娠時期の胎児を病理組織学的に解析し、その死因ならびに発生異常の起こる病態の解明を行った。

Research Products

• [Publications] N.Ishiguro, J.Takamatsu, etal: "Rapidly destructive arthropathy of the hip in haemophilia"Haemophilia. 7. 127-130 (2001)
• [Publications] S.Yokozaki, J.Takamatsu, etal: "Hepatitis C virus RNA dynamics during antiretroviral therapy"Blood. 97. 3318-3319 (2001)
• [Publications] A.Yoshioka, J.Takamatsu, etal: "Safety and efficacy of a new recombinant FVIII for mulated with sucrose(rFVIII-FS) in patients with haemophilia A : a long-term, multicentre clinical trial in Japan"Haemophilia. 7. 242-249 (2001)
• [Publications] H.Toyoda, J.Takamatsu, etal: "TT virus genotype change frequently in multiply transfused patients with hemophilia but rarely in patients with chronic hepatitis C and healthy subjects"Transfusion. 41. 1130-1135 (2001)
• [Publications] J.Takamatsu, H.Toyoda, etal: "Effect of HAART on hepatitis C virus, hepatitis G virus, and TTvirus in multiply-coinfected HIV-positive patients with haemophilia"Haemophilia. (in press).
• [Publications] J.Takamatsu, H.Toyoda, etal: "GBvirus C coinfection and HIV disease progression among HIV-infected patients"N Eng J Med. (in press).