動脈管に存在する、酸素で閉じるカリウムチャンネルに関する分子生物学的研究

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13470214
• Research Institution: Tokyo Women's Medical University
• Principal Investigator: 中西 敏雄 東京女子医科大学, 医学部, 助教授 (90120013)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 相羽 純 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (80138891) ; 松岡 瑠美子 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (50120051) ; 萩原 誠久 東京女子医科大学, 医学部, 助教授 (00180802) ; 羽山 恵美子 東京女子医科大学, 医学部, 助手 ; 中沢 誠 東京女子医科大学, 医学部, 教授 (10075567)
• Keywords: 動脈管 / カリウムチャンネル / 酸素 / クローニング / 遺伝子

Research Abstract

豚新生児血管cDNAライブラリーの作製:豚新生仔の動脈管・大動脈・肺動脈試料からそれぞれtotal RNAを抽出、さらにPoly A^+RNAを精製しMolony murine leukemia virus reverse transcriptase(MMLV-RT)を用いて逆転写反応しcDNAを調製した。0.5kb以上の分画をUni-XAP vector(Stratagene)に挿入し、cDNA libraryを作製した。得られた各血管libraryのtiterおよび平均のinsertの長さは、動脈管で2.56×10^6pfu、1.7kb、大動脈で4.85×10^6pfu、2.7kb、肺動脈で2.52x10^6、2.8kbであった。また、10kbサイズのinsertの存在も確認した。ライブラリースクリーニング:これまでにヒト・ラット・マウスの9種のKvαおよび5種のKvβ cDNAを準備した。これらのcDNAをプローブとして用い、cDNAライブラリーを、非放射性Enhanced Chemi-luminescence法を用いてスクリーニングした。本手法で、豚Kv1、Kv2、Kv9.3(2種)をクローニングした。Homology-based PCR法によるKv遺伝子のスクリーニング: ヒトやラットやマウスなどのKv遺伝子を検討し、種間を通じて相同性の高い領域の塩基配列を選択した。その塩基配列にあわせてPCR用primerを合成し、肺動脈、大動脈、動脈管cDNAをテンプレートとしPCRを行った。動脈管に発現し、他の血管に発現しないか発現が少ない遺伝子を選択し、クローニングした。その結果、動脈管に発現するKV 1.5,2.1,2.2に相同性をもつ遺伝子をクローニングした。