新アグリカナーゼの同定と特異的抗体・ノックアウトマウス作製

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13470312
• Research Institution: OKAYAMA UNIVERSITY
• Principal Investigator: 廣畑 聡 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (90332791)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 米澤 朋子 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (30304299) ; 大橋 俊孝 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 講師 (50194262) ; 二宮 善文 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (70126241) ; 百田 龍輔 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (80263557)
• Keywords: アグリカナーゼ / 細胞外マトリックス / リウマチ性関節炎 / アグリカン / マトリックス分解酵素

Research Abstract

1.リアルタイムPCR法によるADAMTS遺伝子の発現
岡山大学にて樹立されたヒト軟骨肉腫由来細胞株(OUMS-27)をインターロイキン(IL)-1β刺激下に培養し、ADAMTS遺伝子の発現を検討した。刺激後、6,12,24,48時間と経時的に細胞からmRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCRを行い、各ADAMTSの発現を定量的に比較した。内部標準コントロールとしてGAPDHを用いた。ADAMTS-1,2,3,4,5,6,7,8,9のプライマー設計及びリアルタイムPCRの条件設定を行った。アグリカナーゼとしては、ADAMTS-1,4,5が報告されているが、ADAMTS-1,4,5それぞれのOUMS-27細胞におけるIL-1βに対する反応は異なっていた。
また、細胞内情報伝達系の解析を行ったところ、MAPK-JNK pathwayが関与していることが明らかとなった。
2.特異的抗体の作製
ADAMTS-1に対する特異的抗体を2種類作成した。ADAMTS-1の2箇所のペプチドを抗原として家兎に免疫し、抗体を得た。特異性の評価はまず、IL-1β刺激していない培養OUMS-27細胞からタンパクを抽出し、ウエスタンブロッティングで行ったところ、約100kDaのところに一本の明瞭なバンドを認めた。
3.ノックアウトマウス
海外共同研究者との間で、ノックアウトマウス作製を計画し、ES細胞への組み込みが完了した。

Research Products

• [Publications] Takemoto S: "Increased expression of dermatopontin mRNA in the infarct zone of experimentally induced myocardial infarction in rats : comparison with decorin and type I collagen mRNAs"Basic Research in Cardiology. 97(6). 461-468 (2002)
• [Publications] Komata T: "Caspase-8 gene therapy using the human telomerase reverse transcriptase promoter for malignant glioma cells"Hum Gene Ther. 13(9). 1015-1025 (2002)
• [Publications] Hirohata S: "Punctin, a novel ADAMTS-like molecule (ADAMTSL-1) in extracellular matrix"J Biol Chem. 277(14). 12182-12189 (2002)
• [Publications] Hirohata S: "ADAMTS family--new extracellular matrix degrading enzyme"Seikagaku. 73(11). 1333-1337 (2001)
• [Publications] Ayada Y: "Increased expression of biglycan mrna in pressure-overloaded rat heart"Clin Exp Hypertens. 23(8). 633-643 (2001)
• [Publications] Fernandes RJ: "Procollagen II Amino Propeptide Processing by ADAMTS-3. INSIGHTS ON DERMATOSPARAXIS"J Biol Chem. 276(34). 31502-31509 (2001)
• [Publications] Komata T: "FADD gene transfer under the control of the human telomerase reverse transcriptase gene promoter"Int J Oncol. 19(5). 1015-1020 (2001)
• [Publications] Komata T: "Treatment of malignant glioma cells with the transfer of constitutively active caspase-6 using the human telomerase catalytic subunit (human telomerase reverse transcriptase) gene promoter"Cancer Res. 61(15). 5796-5802 (2001)
• [Publications] Koga S: "FADD gene therapy using the human telomerase catalytic subunit (hTERT) gene promoter to restrict induction of apoptosis to tumors in vitro and in vivo"Anticancer Res. 21(3B). 1937-1943 (2001)