基質特異的阻害剤をツールとするグリコシダーゼの生物有機化学的研究

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13480187
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 平竹 潤 京都大学, 化学研究所, 助教授 (80199075)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高田 正保 日本食品化工(株), 研究所, 研究員 ; 水谷 正治 京都大学, 化学研究所, 助手 (60303898)
• Keywords: グリコシダーゼ / グリコシルアミジン誘導 / 基質特異的グリコシダーゼ阻害剤 / 基質アナログ / グリコン特異性 / アグリコン特異性 / アフィニティー吸着体 / グリコシダーゼ精製

Research Abstract

本研究は、きわめて選択的で強力なグリコシダーゼの阻害剤として、本申請者らが開発したグリコシルアミジン誘導体について、その合成的展開と、グリコシダーゼ研究におけるツールとしての応用を目的としたものである。本年度の研究成果は以下のとおりである。
1.酵素のアグリコン部の基質特異性に応じた選択的なグリコシダーゼ阻害剤をテーラーメードに得るため、グリコン部分をglucosylに固定し、アグリコン部にさまざまな構造をもったβ-glucosylamidine誘導体を合成した。そして、アグリコン部に対し高い基質特異性を有するいくつかのβ-グルコシダーゼに対して、その阻害活性を測定した。その結果、アグリコン部に芳香環を好む一連のβ-グルコシダーゼは、アグリコン部に芳香環を有するβ-glucosylamidine誘導体によって強く阻害され、アグリコン部の基質特異性に応じた選択的な阻害が見られた。
2.α-グリコシダーゼに対し選択的に作用する阻害剤を得るべく、グルコースから4段階で得られるα-アジドを、PPh_3で処理することにより、2位の水酸基と1位がα配置で環状イミドを形成したオキサゾリン誘導体を高収率で得ることに成功した。この中間体を鍵として、アミンを反応させることにより、α-グルコシルアミジシを合成するルートが開けつつある。
3.ファミリー18および20に属するN-アセチルヘキソサミニダーゼやキチナーゼは、他のグリコシダーゼと異なり、2位のN-アセチル基の分子内アシストにより、環状オキサゾリンを中間体として反応を触媒する。これらの酵素に対しては、従来型のグルコシルアミジンはほとんど阻害作用を示さないことを見いだし、これが反応機構の違いを反映したものであると考え、酵素反応の中間体に類似した構造の、環状アミジンの合成に着手した。グルコサミンから5段階で保護基のついた環状グルコシルアミジンを合成し、現在、合成の最終ステップを行っている。化合物が得られたら、ファミリー18および20の酵素についての阻害活性を調べ、反応機構と阻害剤の設計についての知見を得る予定である。
4.β-グルコシルアミジンをリガンドとするアフィニティー吸着体を作製し、茶葉から抽出した粗酵素を流すことにより、ワンステップで、2種類のβ-グルコシダーゼを単一にまで精製した。得られた酵素のアミノ酸配列から、それら2種の酵素をコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、アミノ酸配列から、ファミリー3に属する、グルカンヒドロラーゼの一種であることを突きとめた。