SAチャネルの構造機能連関と生理機能の解明

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13480216
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 曽我部 正博 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 教授 (10093428)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 飯田 秀利 東京学芸大学, 教育学部, 教授 (70124435) ; 辰巳 仁史 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (20171720)
• Keywords: SAチャネル / 構造機能連関 / Mid1 / シロイヌナズナ / 心筋 / Kcaチャネル

Research Abstract

我々は、ごく最近、真核生物としては初めてのCa^<2+>透過型SAチャネルの遺伝子(mid1)を同定することに成功した(1999)。本計画はこの発見を土台にして、SAチャネルの構造機能連関と生理機能の解明を目指して、1)Mid1/SAチャネルの構造機能連関の解析、2)高等生物のSAチャネル(mid1ホモログ遺伝子を含む)の同定、および3)mid1およびそのホモログ遺伝子ノックアウト細胞における機械刺激依存性細胞応答のシグナル機構の解析を行う事を目的とする。平成13年度は1)と2)を中心に研究を進め、以下の結果を得た。(1)Mid1の構造機能連関:Mid1は548アミノ酸残基から成り、4つの疎水性領域(H1、H2、H3およびH4)と16箇所の推定上のN-グリコシレーション部位が存在し、C-末端側に二つのシステインリッチ領域が存在する。今回いくつかのdeletion mutantsを作成し、a)Mid1のN-末端の疎水性領域(H1ドメイン)は形質膜への輸送に必要であること、b)N-末端から4番目の疎水性領域(H4ドメイン)からC-末端までの親水性領域の前半は形質膜移行を負に制御し、後半は正に制御していること、c)Mid1の形質膜移行はSec12とSec6に依存した経路を経由すること、などが分かった。またC末端の、システインリッチ領域を含む、Asn389-Asn521の領域がMid1の機能発現に必須であることが判明した。(2)高等生物のSAチャネル遺伝子の同定:a)高等植物シロイヌナズナから二つのmid1ホモログ遺伝子(Atmid1A、Atmid1B)をmid1欠損酵母の機能相補実験により同定した。このうちAtmid1AはCHO細胞への強制発現系を使って電気生理学、とCa^<2+>測光により、これが陽イオン透過性のSAチャネルであるという予備的結果を得た。興味深いことに、Atmid1Aは植物の重力感知部位であるコルメラ細胞と気孔の孔辺細胞に強く発現していることが分かった。b)我々はトリ心筋で、伸展感受性のKcaチャネルを発見しているが、今回その責任遺伝子をクローニングし、塩基配列及び推定アミノ酸配列を決定した。更にこれをCHO細胞に強制発現し、これがnativeに観察されるSAKcaチャネルとほぼ同等なSAチャネル活性を持つことを確認した。

Research Products

• [Publications] Inou H, ishiguro N, Sawazaki S, Amma H, Miyazu M, Iwata H, Sokabe M, Naruse K.: "Uni-axial stretch induces the activation of transcription factor, nuclear factor NFK-B, in human fibrbalast cells"FASEB J. 16. 405-407 (2002)
• [Publications] Murase K, Naruse K, Kimura A, Okumura K, Hayakawa T, Sokabe M.: "Protamine augments stretch induced calcium increase in vascular endothelium"Br J Pharmacol. 134. 1403-1410 (2001)
• [Publications] Wang JG, Matsushita T, Sokabe M, Naruse K.: "Uniaxial cyclic stretch induces focal adhesion kinase(FAK)tyrosine phosphorylation followed by mitogen-activated protein kinase(MAPK) activation"Biochem Biophys Res Comm. 288(2). 356-361 (2001)
• [Publications] Kawakami K, Tatsumi H, Sokabe M.: "Dymanics of integrin at focal adhesion in endothelial cells detected by near field microscopy"J Cell Sci. 114(17). 3125-3135 (2001)
• [Publications] Miyashita T, Tatsumi H, Furuta H, Mori N, Sokabe M.: "Calcium sensitive non-selective cation channel identified in the epithelial cells isolated from the endolymphatic sac of guinea-pigs"J Membr Biol. 182. 113-122 (2001)
• [Publications] Ishida H, Qi Z, Sokabe M, Donowaki K, Inoue Y.: "Molecular design and synthesis of artificial Ion channels based on cyclic peptides containing unnatural amino acids"J Org Chem. 66(9). 2978-2989 (2001)
• [Publications] 曽我部正博, 戚智: "イオンチャネルの分子設計、In「ナノ生体高分子の設計」(城所編)"共立出版. 232 (2001)