液胞型H^+-ピロホスファターゼを対象とした抗マラリア薬の探索と展開研究

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13556013
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 前島 正義 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 教授 (80181577)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小鹿 一 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 教授 (50152492)
• Keywords: 液胞膜 / プロトンポンプ / H^+-ピロホスファターゼ / 阻害剤 / アシルスペルミジン / 軟サンゴ / マラリア

Research Abstract

マラリアは、マラリア病原虫プラスモディウム属がハマダラカを媒体として伝染し、ヒト肝細胞・赤血球に寄生することによる疾患である。本研究は、マラリア原虫がもつH^+輸送性ピロホスファターゼ(H^+-PPase)に焦点をあて、この酵素に対する特異的阻害剤の探索を通して、抗マラリア特効薬を見出し開発することを目的とした。
1.阻害剤に関する研究成果(新規阻害剤の発見)
沖縄の海洋に生息する生物のうち,軟サンゴから得られた成分がもっとも強い阻害活性示した。その成分の化学構造を決定したところ分岐したアシル基をもつアシルスペルミジン類縁化合物であることが判明した。基質加水分解・プロトン輸送活性を強く阻害した(50%阻害濃度1μM)。さらに生きた植物細胞においてもH^+-PPaseを阻害し,その生理機能を強く抑制することが証明された。
2.H^+-PPaseに関する研究成果・新知見
(1)植物H^+-PPaseの遺伝子破壊株の解析により遺伝子欠損は生育の著しい抑制をもたらすこと,ずなわち本酵素が植物体の正常な生育に不可欠であることを明らかにした。
(2)ヤエナリH^+-PPaseの構造・機能協関の解析により,少なくとも2つの細胞質側親水性ループが基質結合・触媒部位を形成し,その中の保存性の高いアミノ酸残基が基質加水分解を司っていることを明らかにした。
(3)変異導入とそれに引き続く機能検定のやりやすい大腸菌発現系の確立を目的に,放線菌H^+-PPaseを対象に解析を進めた。実験系の確立に成功し,放線菌H^+-PPaseの固有の性質を明らかにした。
(4)H^+-PPase機能の直接測定のためのパッチクランプ法を世界に先駆けて開発し,H^+-PPaseの特質,分子活性をもっとも精度の高い方法で明らかにした。

Research Products

• [Publications] Frangne, N.: "Expression and distribution of vacuolar aquaporin in young and mature leaf tissues of Brassica napus in relation to water fluxes"Planta. 212. 270-278 (2001)
• [Publications] Suga, S.: "Specificity of the accumulation of mRNAs and proteins of the plasma membrane and tonoplast aquaporins in radish organs"Planta. 212. 294-304 (2001)
• [Publications] Nakanishi, Y.: "Mutagenic analysis of functional residues in putative substrate binding site and acidic domains of vacuolar H^+-pyrophosphatase"Journal of Biological Chemistry. 276. 7654-7660 (2001)
• [Publications] Maeshima, M.: "Tonoplast transporters : organization and function"Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 52. 469-497 (2001)
• [Publications] Kawamura, Y.: "ATP analogue binding to the A subunit induces conformational change of the E subunit that involves a disulfide bond formation in plant V-ATPase"European Journal of Biochemistry. 268. 2801-2809 (2001)
• [Publications] Yuasa, K.: "Organ specificity of a vacuolar Ca^<2+>-binding protein RVCaB in radish and its expression under Ca^<2+>-deficient conditions"Plant Molecular Biology. 47. 633-640 (2001)
• [Publications] Ohshima, Y.: "Low aquaporin content and low osmotic water permeability of the plasma and vacuolar membranes of a CAM plant Graptopetalum paraguayense : comparison with radish"Plant and Cell Physiology. 42. 1119-1129 (2001)
• [Publications] Jiang, L.: "The protein storage vacuole : a unique compound organelle"Journal of Cell Biology. 155. 991-1002 (2001)
• [Publications] Ikeda, M.: "Expression of V-ATPase proteolipid subunit of Acetabularia acetabulum in a VMA3-deficient strain of Saccharomyces cerevisiae and its complementation study"European Journal of Biochemistry. 268. 6097-6104 (2001)
• [Publications] Ikeda, M.: "Functional expression of Acetabularia acetabulum vacuolar H^+-pyrophosphatase in a yeast VMA3-deficient strain"Journal of Experimental Botany. 53. 2273-2275 (2002)
• [Publications] Yuasa, K.: "Equilibrium dialysis measurements of the Ca^<2+>-binding properties of recombinant radish vacuolar Ca^<2+>-binding protein expressed in E.coli"Biosciences Biotechnology and Biochemistry. 66. 2382-2387 (2002)
• [Publications] Suga, S.: "Aquaporin isoforms responsive to salt and water stresses and phytohormones in radish seedlings"Plant and Cell Physiology. 43. 1229-1237 (2002)
• [Publications] Fujiwara, S.: "Molecular properties of unique matrix attachment region-binding protein in tobacco cells"Plant and Cell Physiology. 43. 1558-1567 (2002)
• [Publications] Yang, S.: "Modulation of vacuolar H^+-pumps and aquaporin by photohormones in rice seedling leaf sheaths"Bio.Pharm.Bull.. 26. 88-92 (2002)
• [Publications] Mimura, T.: "Rapid increase of vacuolar volume in response to salt stress"Planta. 216. 397-402 (2003)
• [Publications] Suga, S.: "An abundance of aquaporins in specific cells and osmotic water permeability of individual protoplasts of radish"Plant and Cell Physiology. 44. 277-286 (2003)
• [Publications] Hirono, M.: "Acylspermidine derivatives isolated from a soft coral Sinularia sp. inhibits plant vacuolar H^+-pyrophosphatase"Journal of Biochemistry. 133. 811-816 (2003)
• [Publications] Nakanishi, Y.: "Patch clamp analysis of H^+ pump expressed in giant yeast vacuoles"Journal of Biochemistry. 134. 615-623 (2003)
• [Publications] Kamiya, T.: "Residues in internal repeats of the rice cation/H^+ exchanger are involved in the transport and selection of cations"Journal of Biological Chemistry. 279. 812-819 (2004)
• [Publications] Fukuda, A.: "Effect of salt and osmotic stresses on the expression of genes for the vacuolar H^+-pyrophosphatase, H^+-ATPase subunit A and Na^+/H^+ antiporter from barley"Journal of Experimetal Botany. 55. 585-594 (2004)
• [Publications] Geisler, M: "Arabidopsis immunophilin-kike TWD1 modulates vacuolar ABC transporter activity by means of protein-protein interaction"Molecular Biology of the Cell. (In press). (2004)
• [Publications] 中西 洋一: "液胞のCa^<2+>集積とプロトンポンプ"蛋白質核酸酵素. 47. 1777-1782 (2002)
• [Publications] 須賀 しのぶ: "液胞膜の分化と多様性"細胞工学別冊 植物細胞工学. 17. 190-195 (2002)
• [Publications] 前島 正義: "液胞膜H^+-ピロホスファターゼと膜ダイナミクス"細胞工学. 12. 1522-1527 (2002)
• [Publications] 中西 洋一: "液胞型H^+-ポンプ"細胞工学別冊 植物細胞工学. 18. 4-39 (2003)
• [Publications] 三村 久敏: "膜輸送システムの分子構造と機能"細胞工学別冊 植物細胞工学. 18. 199-205 (2003)
• [Publications] 前島 正義: "膜輸送系の研究に利用される阻害剤と蛍光プローブ"細胞工学別冊 植物細胞工学. 18. 224-229 (2003)
• [Publications] 前島 正義: "液胞と代謝-物質集積とコミュニケーション"蛋白質・核酸・酵素. 48. 2184-2191 (2003)
• [Publications] 前島正義: "ストレスの植物生化学・分子生物学(第14章、第15章分担執筆)"学会出版センター. 308 (2001)
• [Publications] 前島正義: "朝倉植物生理学講座 第2巻代謝(第3章エネルギー代謝分担執筆)"朝倉書店. 175 (2001)
• [Publications] Maeshima, M.: "Handbook of Plant Growth. pH as a Master Variable in Plant Growth(分担執筆)"Marcel Dekker, Inc.. 446 (2002)