ナノリットルスケール蛋白質結晶化および結晶直接評価法の開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13558086
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 渡邉 信久 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (70212321)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西村 訓弘 (株)ジェネティックラボ, 主任研究員 ; 姚 閔 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助手 (40311518) ; 田中 勲 北海道大学, 大学院・理学研究科, 教授 (70093052)
• Keywords: タンパク質結晶化 / 結晶化ロボット / 結晶評価

Research Abstract

本年度は2年計画の1年目として,研究実施計画に基づき以下の開発研究を実施した.
1.ナノリットルオーダーの結晶化ドロップ作成の自動化
精密分注機HYDRA-96(100μL仕様)を改造し,ナノリットルドロップの結晶化装置を製作した.具体的には,蛋白質溶液の分注用に8本のシリンジをHYDRA-96の96本のシリンジの駆動部に敷設し,コンパクトで高速な結晶化ドロップ作成装置を実現した.現在,本装置で再現性良く作成可能な結晶化ドロップサイズは500nLである.また96条件の結晶化ドロップの作成を約3分で終了出来る.来年度の実現を目指し,50nLのドロップ作成を目指した改良を検討中である.
2.結晶化ドロップのX線直接評価法の開発
結晶化ドロップから結晶を取り出さなくても,そのまま結晶化ドロップに直接X線を照射することが出来る構造であり,かつハンギングドロップ法とシッティングドロップ法の両方の可能な結晶化プレートを設計し試作した.特に,通常の研究室に普及しているCu Kα(1.54Å)のX線を使用して評価出来るようにするため,本プレートのX線通過部分は薄いフィルム状とした.
リゾチームを用いて,上記の結晶化装置と結晶化プレートで結晶化を実施し,結晶化ドロップのまま直接X線照射し回折像を撮影することに成功した.本手法によれば評価のためにわざわざ結晶化ドロップから結晶を取り出す必要が無く,結晶に物理的なダメージを与えずに,結晶化条件の差による結晶性の影響のみを純粋に評価することが出来る.
なお,本研究の概要を3月末にイエナ(ドイツ)で開催される第9回国際生体高分子結晶成長学会で発表する予定である.