Mo,Tなどの原子薄膜を極低温超高真空下で作製できる凍結レプリカ装置の試作

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13558091
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 臼倉 治郎 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (30143415)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木村 政史 (株)日立サイエンスシステムズ, 電子装置システム設計部, 主任研究技師
• Keywords: 凍結レプリカ装置 / 電子顕微鏡 / 膜の裏打ち / フリーズエッチング / アクチン / 急速凍結 / 免疫細胞化学 / 細胞膜

Research Abstract

本研究の目的は膜と細胞骨格などの相互作用を分子レベルで形態解析できるような新しい凍結エッチング装置の開発とそれを用いた膜構造の解析であった。我々の作製した装置は真空度約1×10-6Pa、温度は室温と-160oCの間で制御できる。さらに、この装置ではタングステンやモリブデンなど高融点金属を超高真空中で蒸着できるため、従来の白金レプリカに比べ、極めて分解能が高くなった。また、ミクロトームタイプの切削装置を備えているため、ダイヤモンドナイフで10nmの精度で膜直下まで削ることが出来る。このため、試料を必ずしも洗剤で洗い流す必要はなく、そのままで観察が可能である。したがって、洗剤による酸化などでのレプリカ膜の劣化を心配する必要がなく、白金以外のより粒子の細かい高融点金属を蒸着原として使用することが出来る。X線結晶回折と比べると劣るが、10nmぐらいの分解能で蛋白分子などを観察するには重宝である。応用面では急速凍結デイープエッチ免疫レプリカ電顕法で、細胞膜の細胞質側表面を全面にわたって観察することができるようになった。これによって、細胞膜の近傍での膜骨格の形態や構造が明らかになりつつある。さらに、免疫金コロイド標識によって膜骨格は主にアクチンとスペクトリン、アデューシン、ゲルゾリンなどのアクチン結合タンパク質からなることがわかってきた。また、アクチンの枝分かれを可能にするArp2/3蛋白も同定することが出来た。クラスリン被覆ピットやカベオラと膜骨格との結合も見えはじめた。またこれらを定量的に解析するために三次元再構築を試みた。±45°の間で1°ずつ90枚の写真を撮り膜裏打ち構造のアニメーションを作ることに成功した。

Research Products

• [Publications] Jiro Usukura: "A critical role for ATP in the stimulation of retinal guanylyl cyclase by Guanylyl cyclase-activated proteins (GCAPs)"J. Biol, Chem.. (In press).
• [Publications] Jiro Usukura: "DEAD-box protein rck/p54 unwinds double-stranded RNAs and has RNase activity"Gene to cells. (In press). 163-179 (2002)
• [Publications] Jiro Usukura: "Mechanism of leflunomide-induced proliferation of mitochondria in mammalian cells"Mitochondrion. 2. 163-179 (2002)
• [Publications] Jiro Usukura: "Clamp and clamp loader structures of the human checkpoint protein complexes Rad9-1-1 and Rad17-RFC"Gene to Cells. 7. 861-868 (2002)