2002 Fiscal Year Annual Research Report
枯草菌のDNA受容能と菌体外酵素生産を制御するDegUの分子解剖
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13660100
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| Research Institution | TOKAI UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
小倉 光雄 東海大学, 海洋学部, 助教授 (80204163)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 暉夫 東海大学, 海洋学部, 教授 (10236606)
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| Keywords | 枯草菌 / 2成分制御系 / DNA結合タンパク質 / DegU |
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| Research Abstract |
DegS-DegU2成分制御系は分解系酵素遺伝子を含む多くの遺伝子発現を制御している.この系のレギュレーターDegUはC末端側にHelix-Turn-Helix構造を持つ。非リン酸化型DegUがDNA受容能の中心的制御因子をコードするcomK遺伝子プロモーターに結合し、リン酸化型DegUはaprE(アルカリプロテアーゼ遺伝子)転写を活性化するが、aprEプロモーターへの結合は今まで示されていない。DegUのDNA結合に重要なアミノ酸を知るため、H-T-H領域の27残基をそれぞれAla置換した変異DegUを作成し、解析した。さらにDegUの標的配列を明らかにするためにcomKのプロモーターに様々な塩基置換を導入し、その効果を測定した。HisタグDegUをコードする遺伝子を染色体のdegU破壊と同時にamyE部位に導入して、変異DegUの効果を調べると、N183A、I192A、T196A、H200A、L205AがcomKの標的であるcomG-lacZを発現させられなかった。Western解析では、これら変異タンパク質の安定性は野生型と同様だった。5つの変異タンパク質を精製しゲルシフト解析でcomKプロモーターDNAに結合できないことを確認した。次に、リン酸化DegUを安定化させる効果を持つことが知られているdegRを多コピーで導入した株で、変異degUのaprE-lacZ発現に及ぼす影響を調べた。その結果、上記5つの変異に加えて、K195A、N199A、V201A、S202A、を加えた全部で9の変異がaprE-lacZ発現を低下させる事を見出した。野生型とこれらの変異DegUのゲルシフト解析を行ったところ、野生型DegUはaprEプロモーターに結合したが、変異DegU全てのDNA結合性が減少していた。この事から、DegUが認識する塩基配列はリン酸化によって大きく変化しないことが示唆された。次に、comKプロモーターのDegU結合領域の塩基を置換したlacZ fusionによる解析で、DegUの認識配列GNNATTTA-N7-TAAATNNCを明らかにした。aprEプロモーターのDegU標的領域にはこれと似た配列が2箇所あった。
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[Publications] Ogura, M., Hashimoto, H., Tanaka, T: "Med, a cell-surface locolized protein regulating a comperemce transcription factor gene, comk, in B subtilis"Biosci. Bio technol. Biochem.. 66・4. 892-896 (2002)
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[Publications] Ogura, M., Yamaguchi, H., Kobayashi, K., Ogasawara, N., Fujita, Y., T.Tanaka: "Whole genome oralysis of genes regulated by the Bacillus subtilis competence transcription factor comk"J.Bacteriology. 184・9. 2344-2351 (2002)
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[Publications] Ogura, M., Tanaka, T.: "Recent progress in Bacillus subtilis two-compohent regulation"Frontiers in Bioscience. 7・8. 1815-1824 (2002)
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[Publications] Nonomiya, H., Shiomi, E., Ogura, M., Tanaka, T., Asai, K., Kawamura, F.: "Involvement Clpx protein in the post-transcritional regulation of a competence specific transcription factor Comk protein of Bacillus subtilis"J. Biochemistry. 133・3(in press). (2003)
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[Publications] Kobayashi, K., et al.: "Bacilus subtilis essential genes"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (in press). (2003)
